IVT mRNA előkészítése

A vitro transzkripció (IVT) az mRNA előkészítésének legjobb módszere, amely mikrogramtól milligramig mRNA-t termel laboratóriumi méretben. A kutatási célokra a reagensgyártók kifejlesztettek flexibilis IVT reakciós rendszereket közepes hosszúságú (1000-4000 nukleotid) mRNA-ra.

Ebben a cikkben összefoglaljuk az mRNA vitro transzkripcióját (IVT), beleértve a konvencionális IVT reakciós rendszert, amelyet laboratóriumi méretben használnak, valamint azt az IVT reakciós rendszert, amely alkalmas ultra-hosszú mRNA-ra (>9000 nukleotid).

A tesztkészletek lehetővé teszik a co-transzkripciós fedetést CleanCap AG-vel és csökkentik az immunogénitást m1ψ-val. A DNase I eltávolítja az maradék DNA-t. Az alacsony teljesítmény rossz keverés, reagens oxidáció vagy DNA-sablon problémák miatt fordulhat elő, amelyeket centrifulálással, friss reagenssekkel, ellenőrzésekkel és a sablonmennyiség/szintaktidő módosításával lehet enyhíteni.

A Yaohai Bio-Pharma különböző előkészített IVT RNA termékeket (folyadék/fagyasztott por) és LNP végtermékeket kínál, amelyek fekete fénylő baktériumok (eGFP, mCHERRY), luciferáz, rekombináns Cre és antigén OVA fekvő proteineket kódolnak, hogy különböző kísérleti vagy projekt igényeket kelljen kielégíteni.

Ultra-hosszú mRNA IVT rendszer

Az általános IVT nem mindig működik túl hosszú mRNA-k esetén (>9000 nukleotid). A komponensek mély megértése és racionális alkalmazása szükséges az IVT-hez.

DNA-sablon: Lineáris plazmidok vagy PCR produktek a megfelelő promotor sorozattal, amelyek RNase-in mentes H2O-ban oldva vannak. Ajánlott 40 nM-nál magasabb DNA-sablon koncentráció optimális IVT feltételekhez.

DTT: Enzymaktivitás fenntartása a transzkripció alatt. Friss DTT-t adjon hozzá a reakciós puffert egy optimalizált enzimaktivitás érdekében.

RNase inhibitor: Inhibálja az RNase aktivitását és fenntartja az mRNA stabilitását.

T7 RNA-polinérmáza: Katalizálja a DNA transzkripcióját RNA-ra, amely megfelel a promotor sorozatnak. A T7 RNA polymeráz tevékenysége a pH és a magnánziók hatására változik.

Magnánziok (Mg2+): Kofaktor az RNA polymeráz számára. Túl alacsony koncentrációk csökkentik a transzkripció hatékonyságát, míg túl magas koncentrációk vezetnek RNA degradációhoz. A szabad [Mg2+] koncentrációt a nukleotid koncentráció alapján kell szabályozni. Mindegyik nukleotid egy [Mg2+] iont köt, ezért a [Mg2+] koncentráció meghaladnia kell a teljes nukleotid koncentrációt.

Nukleozid Trifoszfátok (NTP): Substrátként az NTP-k az RNA alapvető egységei. Az 7 mM-nél magasabb NTP koncentrációk pozitív hatással bírnak az mRNA gyártásra.

Spermidin: Stabilizálja a DNA-enzim komplexeket és stimulálja a transzkripció reakciókat; azonban túl magas koncentrációk inhibáló hatással bírnak. A javasolt spermidin koncentráció 1 és 3 mM között van.

Inorganikus Pirofoszfatazas (PPase): Hozzáadva az IVT-reakciókhoz az inorganikus pirifoszfát-ionok (PPi) felhalmozódásának elkerülése érdekében, amelyek chelációját Mg2+val elkerülve biztosítja a szabad Mg2+ elegendő mennyiségét.

A bonyolult technológiák és IVT mRNA tapasztalatok felhasználásával a Yaohai Bio-Pharma egyedülálló IVT RNA szolgáltatást nyújt, amely soronkénti sorrendben tartalmazza a sorozat tervezését, az IVT RNA készítését (m1ψ módosításokkal), az RNA ciklizálását, tisztítását, fagylaltázását, LNP zárkonzását és minőségtapasztalatot.

Aktívan keresünk intézményi vagy egyéni globális partnereket. A legversenyképesebb kompenzációt kínáljuk az iparágban. Ha bármilyen kérdése van, kérjük, vegye fel velünk a kapcsolatot: [email protected]