Proceso de fabricación del ARNm de eGFP

La producción de ARNm de eGFP (proteína fluorescente verde mejorada) implica una serie de técnicas de biología molecular para generar una molécula de ARN funcional que codifique la expresión de eGFP. En el área del ARNm de eGFP, Yaohai Bio-Pharma ha acumulado una amplia experiencia en la atención de las necesidades específicas de los clientes. Aprovechando nuestra experiencia, hemos sintetizado el flujo de proceso para producir ARNm de EGFP.

1. Clonación del gen eGFP:Se trata de obtener la secuencia del gen que codifica eGFP. Este gen se clona normalmente a partir de un vector plasmídico preexistente o se sintetiza artificialmente a partir de la secuencia de nucleótidos conocida. El gen clonado se verifica luego mediante secuenciación para garantizar su precisión.
2. Optimización de genes para la expresión:Para lograr una expresión óptima en el sistema de destino (por ejemplo, células de mamíferos, bacterias o sistemas de transcripción in vitro), el gen eGFP puede someterse a una optimización de codones. Esto implica reemplazar codones raros en la secuencia original por otros que se usan con más frecuencia en el organismo huésped, lo que aumenta las posibilidades de una traducción eficiente.
3. In vitro Preparación de la plantilla de transcripción:Una vez que el gen optimizado está listo, se incorpora a un vector adecuado, a menudo un plásmido, que contiene elementos reguladores necesarios para la transcripción (por ejemplo, una secuencia promotora). Este plásmido sirve como plantilla para la transcripción in vitro.
4. In vitro Transcripción:Utilizando la plantilla de plásmido preparada, se realiza la transcripción in vitro para sintetizar el ARNm de eGFP. Este proceso implica el uso de enzimas ARN polimerasas, que reconocen la secuencia promotora e inician la transcripción, produciendo una cadena de ARN complementaria a la plantilla de ADN. Dependiendo de la aplicación deseada, el ARNm puede ser protegido, poliadenilado y/o modificado para mejorar la estabilidad y la eficiencia de la traducción.
5. Purificación y Control de Calidad:El ARNm de eGFP sintetizado se purifica luego para eliminar cualquier contaminante, incluido ADN, proteínas y nucleótidos libres. Los métodos de purificación pueden incluir electroforesis en gel, cromatografía en columna o separación con microesferas. Después de la purificación, se analiza el ARNm para determinar su calidad, incluida la concentración, la pureza y la integridad, mediante técnicas como la espectrofotometría UV-Vis y la electroforesis en gel.
6. Almacenamiento y Entrega:El ARNm de eGFP purificado se suele almacenar a bajas temperaturas para mantener la estabilidad. Para uso experimental, el ARNm se puede administrar a las células mediante diversos métodos, como la electroporación, la lipofección o los vectores virales, según la aplicación específica y el tipo de célula de destino.
7. Expresión y verificación:Una vez dentro de la célula, el ARNm de eGFP se traduce en la proteína fluorescente verde mejorada, que se puede visualizar mediante microscopía de fluorescencia. Esto permite verificar la producción, administración y expresión exitosas del ARNm.

En resumen, la producción de ARNm de eGFP implica clonar el gen, optimizarlo para su expresión, preparar una plantilla de transcripción in vitro, realizar la reacción de transcripción, purificar el ARNm resultante y, finalmente, entregarlo a las células para su expresión y verificación.

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