Proceso de Fabricación del ARN de eGFP

La producción de mRNA de eGFP (Proteína Fluorescente Verde Mejorada) implica una serie de técnicas de biología molecular para generar una molécula de RNA funcional que codifique para la expresión del eGFP. En el área de mRNA de eGFP, Yaohai Bio-Pharma ha acumulado amplia experiencia para atender las necesidades específicas de los clientes. Aprovechando nuestra experiencia, hemos sintetizado el flujo de proceso para producir mRNA de EGFP.

1. Clonación del gen eGFP : Se obtiene la secuencia génica que codifica para el eGFP. Este gen generalmente se clona a partir de un vector plásmido preexistente o se sintetiza artificialmente basándose en la secuencia de nucleótidos conocida. El gen clonado luego se verifica mediante secuenciación para asegurar su precisión.
2. Optimización del gen para expresión : Para una expresión óptima en el sistema objetivo (por ejemplo, células mamíferas, bacterias o sistemas de transcripción in vitro), el gen eGFP puede someterse a optimización de codones. Esto implica reemplazar codones raros en la secuencia original por otros más frecuentemente utilizados en el organismo huésped, aumentando las posibilidades de una traducción eficiente.
3. In vitro Preparación de la Plantilla de Transcripción : Una vez que el gen optimizado está listo, se incorpora en un vector adecuado, a menudo un plásmido, que contiene elementos regulatorios necesarios para la transcripción (por ejemplo, una secuencia promotora). Este plásmido sirve como plantilla para la transcripción in vitro.
4. In vitro Transcripción : Usando la plasmida preparada como plantilla, se realiza la transcripción in vitro para sintetizar el mRNA de eGFP. Este proceso implica el uso de enzimas polimerasas de RNA, las cuales reconocen la secuencia promotora e inician la transcripción, produciendo una hebra de RNA complementaria a la plantilla de ADN. Dependiendo de la aplicación deseada, el mRNA puede ser acapado, poliadenilado y/o modificado para mejorar su estabilidad y eficiencia de traducción.
5. Purificación y Control de Calidad : El mRNA de eGFP sintetizado se purifica luego para eliminar cualquier contaminante, incluyendo ADN, proteínas y nucleótidos libres. Los métodos de purificación pueden incluir electroforesis en gel, cromatografía de columna o separación basada en partículas magnéticas. Después de la purificación, el mRNA se analiza por calidad, incluyendo concentración, pureza e integridad, utilizando técnicas como espectrofotometría UV-Vis y electroforesis en gel.
6. Almacenamiento y Entrega : El ARN mensajero de eGFP purificado se almacena típicamente a bajas temperaturas para mantener su estabilidad. Para su uso experimental, el ARNm puede ser introducido en las células mediante varios métodos, incluyendo electroperforación, lipofección o vectores virales, dependiendo de la aplicación específica y del tipo de célula objetivo.
7. Expresión y Verificación : Una vez dentro de la célula, el ARNm de eGFP se traduce en la proteína de fluorescencia verde mejorada, la cual puede ser visualizada utilizando microscopía de fluorescencia. Esto permite verificar la producción exitosa de ARNm, su entrega y expresión.

En resumen, la producción de ARNm de eGFP implica clonar el gen, optimizarlo para su expresión, preparar una plantilla de transcripción in vitro, realizar la reacción de transcripción, purificar el ARNm resultante y, finalmente, introducirlo en las células para su expresión y verificación.

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