Preparación de mRNA por IVT

La transcripción in vitro (IVT) es el método preferido para preparar mRNA, capaz de producir microgramos a miligramos de mRNA a escala de laboratorio. Para fines de investigación, los proveedores de reactivos han desarrollado sistemas de reacción IVT versátiles adecuados para mRNA de longitud moderada (1000-4000 nucleótidos).

En este artículo, resumiremos la transcripción in vitro (IVT) de mRNA, incluidos el sistema de reacción IVT convencional utilizado a escala de laboratorio y el sistema de reacción IVT adecuado para mRNA ultra-largo (>9000 nucleótidos).

Los kits permiten la tapado co-transcripcional con CleanCap AG y reducen la inmunogenicidad con m1ψ. La DNasa I elimina el ADN residual. Una baja rendimiento puede ser debido a una mezcla insuficiente, oxidación de los reactivos o problemas con la plantilla de ADN, lo cual se puede mitigar mediante centrifugación, reactivos frescos, controles y ajustando la cantidad de plantilla/tiempo de reacción.

Yaohai Bio-Pharma ofrece varios productos de RNA IVT prefabricados (líquido/polvo liofilizado) y productos terminados LNP, codificando proteínas como proteínas fluorescentes (eGFP, mCHERRY), luciferasa, recombinasa Cre y antígeno OVA, para satisfacer diferentes necesidades experimentales o de proyecto.

Sistema IVT para mRNA ultralargo

El IVT convencional puede no funcionar para mRNA demasiado largo (>9000 nt). Se necesita una comprensión profunda y un ajuste racional de los componentes del IVT.

Plantilla de ADN: Plásmidos linealizados o productos de PCR con secuencias de promotores correspondientes, disueltos en H2O libre de RNasa. Se recomienda una concentración de plantilla de ADN superior a 40 nM para condiciones óptimas de IVT.

DTT: Mantiene la actividad enzimática durante la transcripción. Se debe añadir DTT fresco al buffer de reacción para mantener la actividad enzimática óptima.

Inhibidor de RNasa: Inhibe la actividad de la RNasa y mantiene la estabilidad del mRNA.

Polimerasa T7 RNA: Cataliza la transcripción de ADN en ARN, correspondiente a la secuencia del promotor. La actividad de la polimerasa de ARN T7 se ve afectada por el pH y los iones de magnesio.

Iones de Magnesio (Mg2+): Un cofactor para la polimerasa de ARN. Concentraciones demasiado bajas reducen la eficiencia de la transcripción, mientras que concentraciones demasiado altas provocan degradación del ARN. El [Mg2+] libre debe ajustarse según la concentración de nucleótidos. Cada nucleótido chela un [Mg2+], por lo que la concentración de [Mg2+] debe superar la concentración total de nucleótidos.

Tri fosfatos de nucleósidos (NTP): Como sustratos, los NTP son las unidades básicas del ARN. Las concentraciones de NTP por encima de 7 mM tienen un impacto positivo en la producción de mRNA.

Spermidina: Estabiliza los complejos ADN-enzima y estimula las reacciones de transcripción; sin embargo, concentraciones excesivas tienen efectos inhibidores. La concentración recomendada de spermidina está entre 1 y 3 mM.

Pirofosfatasa inorgánica (PPase): Añadido a las reacciones de IVT para prevenir la acumulación de iones de pirrofosfato inorgánico (PPi), evitando su quelación con Mg2+ y asegurando suficiente Mg2+ libre.

Aprovechando tecnología pionera y experiencia en mRNA de IVT, Yaohai Bio-Pharma ofrece un servicio integral de IVT RNA, que abarca el diseño de secuencias, la preparación de IVT RNA (con modificaciones de m1ψ), la ciclización del ARN, la purificación, la liofilización, la encapsulación en LNP y las pruebas de calidad.

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