Preparación de ARNm de IVT

La transcripción in vitro (IVT) es el método preferido para preparar ARNm, capaz de producir de microgramos a miligramos de ARNm a escala de laboratorio. Para fines de investigación, los proveedores de reactivos han desarrollado sistemas de reacción IVT versátiles adecuados para ARNm de longitud moderada (1000-4000 nucleótidos).

En este artículo, resumiremos la transcripción in vitro (IVT) de ARNm, incluido el sistema de reacción IVT convencional utilizado a escala de laboratorio y el sistema de reacción IVT adecuado para ARNm ultralargos (>9000 nucleótidos).

Los kits permiten la protección cotranscripcional con CleanCap AG y reducen la inmunogenicidad con m1ψ. La DNasa I elimina el ADN residual. El bajo rendimiento puede deberse a una mala mezcla, oxidación de reactivos o problemas con la plantilla de ADN, que se pueden mitigar mediante centrifugación, reactivos nuevos, controles y ajuste de la cantidad de plantilla/tiempo de reacción.

Yaohai Bio-Pharma ofrece varios productos de ARN IVT prefabricados (líquido/polvo liofilizado) y productos terminados LNP, que codifican proteínas como proteínas fluorescentes (eGFP, mCHERRY), luciferasa, recombinasa Cre y antígeno OVA, para satisfacer diferentes necesidades experimentales o de proyectos.

Sistema IVT para ARNm ultralargo

La técnica de transmisión intravital convencional puede no funcionar con ARNm demasiado largo (>9000 nt). Se necesita una comprensión profunda y un ajuste racional de los componentes de la técnica de transmisión intravital.

Plantilla de ADN: Plásmidos linealizados o productos de PCR con las secuencias promotoras correspondientes, disueltos en H2O sin ARNasa. Se recomienda una concentración de plantilla de ADN superior a 40 nM para condiciones óptimas de IVT.

TDT: Mantiene la actividad enzimática durante la transcripción. Se debe agregar DTT fresco al tampón de reacción para lograr una actividad enzimática óptima.

Inhibidor de la ARNasa: Inhibe la actividad de la ARNasa y mantiene la estabilidad del ARNm.

ARN polimerasa T7: Cataliza la transcripción del ADN en ARN, correspondiente a la secuencia promotora. La actividad de la ARN polimerasa T7 se ve afectada por el pH y los iones de magnesio.

Iones de magnesio (Mg2+): Un cofactor de la ARN polimerasa. Las concentraciones demasiado bajas reducen la eficiencia de la transcripción, mientras que las concentraciones demasiado altas conducen a la degradación del ARN. La concentración de [Mg2+] libre debe ajustarse en función de la concentración de nucleótidos. Cada nucleótido forma un quelato de [Mg2+], por lo que la concentración de [Mg2+] debe superar la concentración total de nucleótidos.

Nucleósidos trifosfatos (NTP): Como sustratos, los NTP son las unidades básicas del ARN. Las concentraciones de NTP superiores a 7 mM tienen un impacto positivo en la producción de ARNm.

Espermidina: Estabiliza los complejos ADN-enzima y estimula las reacciones de transcripción; sin embargo, concentraciones excesivas tienen efectos inhibidores. La concentración recomendada de espermidina es entre 1 y 3 mM.

Pirofosfatasa inorgánica (PPasa): Se añade a las reacciones IVT para evitar la acumulación de iones pirofosfato inorgánico (PPi), evitando su quelación con Mg2+ y asegurando suficiente Mg2+ libre.

Aprovechando la tecnología pionera y la experiencia en ARNm de IVT, Yaohai Bio-Pharma ofrece un servicio integral de ARN de IVT, que abarca el diseño de secuencias, la preparación de ARN de IVT (con modificaciones m1ψ), la ciclización de ARN, la purificación, la liofilización, la encapsulación de LNP y las pruebas de calidad.

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