Técnicas de ensamblaje innovadoras para la síntesis de genes a gran escala

La tecnología de ensamblaje para sintetizar grandes fragmentos de ADN desde cero es la piedra angular de la síntesis génica y abarca métodos como BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, ensamblaje Gibson, CPEC y PCR por superposición. Debido a las limitaciones de la tecnología actual para sintetizar con precisión ADN de la longitud de un gen en un solo paso, es necesario combinar técnicas de ensamblaje in vitro e in vivo para ensamblar fragmentos de oligonucleótidos sintetizados en segmentos en fragmentos largos de ADN.

Técnicas de ensamblaje in vitro

Se clasifican en varios métodos según el tamaño del fragmento y las características de la secuencia, con un requisito común para usar enzimas de herramienta. La PCR de superposición, basada en el método de la ADN polimerasa, es simple y rápida en su funcionamiento. Los métodos BioBrick y BglBrick, que se basan en isoesquizómeros, permiten un ensamblaje estandarizado, aunque el método BioBrick no es adecuado para las proteínas de fusión. El método de clonación Golden Gate, basado en enzimas de restricción de tipo IIS, permite una ligadura eficiente y sin fisuras de múltiples fragmentos. El método de ensamblaje de Gibson, que utiliza una combinación de múltiples enzimas de herramienta, permite una ligadura sin fisuras con tamaños de fragmentos que alcanzan varios cientos de kb. El diseño estandarizado de los componentes del ADN mejora la tasa de utilización de los fragmentos existentes.

Técnicas de ensamblaje in vivo

Aunque in vitro Los fragmentos ensamblados pueden alcanzar varios cientos de kb de tamaño, el rendimiento es a menudo insuficiente, lo que requiere una amplificación utilizando organismos como Escherichia coli. Para ensamblar fragmentos que superan los 20 kb, se suelen emplear sistemas recombinantes dentro de organismos, como Bacillus subtilis, levaduras y bacterias modificadas genéticamente. La levadura, como hospedador de uso común, ha sido reconocida por su eficiente capacidad de recombinación homóloga durante muchos años. Se puede utilizar para ensamblar cromosomas artificiales de hasta varias megabases (Mb) de longitud. Además, Saccharomyces cerevisiae muestra una tolerancia extraordinaria a la longitud de los cromosomas, lo que proporciona una base teórica para utilizar la levadura para construir cromosomas ultralargos en organismos superiores.

Aplicaciones

Yaohai Bio-Pharma emplea principalmente dos métodos de ensamblaje para la síntesis de genes: ensamblaje de ligasa y ensamblaje de ADN polimerasa. El método de ensamblaje de ligasa conecta fragmentos de oligonucleótidos superpuestos e hibridados fosforilados en 5' en ADN de doble cadena utilizando ADN ligasa. El método de ensamblaje de polimerasa utiliza ADN polimerasa para extender los fragmentos de oligonucleótidos superpuestos a través de la hibridación, obteniendo una mezcla de diferentes longitudes y, finalmente, amplificando los fragmentos de longitud completa ensamblados con éxito utilizando cebadores. Yaohai puede ayudar a los clientes a satisfacer requisitos específicos en la síntesis de genes.

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