Técnicas de Montaje Innovadoras para la Síntesis de Genes a Gran Escala

La tecnología de ensamblaje para sintetizar fragmentos de ADN grandes desde cero es la base de la síntesis de genes, e incluye métodos como BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, ensamblaje Gibson, CPEC y Overlap PCR. Debido a las limitaciones de la tecnología actual para sintetizar con precisión fragmentos de ADN de longitud genética en un solo paso, es necesario combinar técnicas de ensamblaje in vitro e in vivo para ensamblar fragmentos de oligonucleótidos sintetizados por segmentos en fragmentos de ADN largos.

Técnicas de ensamblaje in vitro

Se clasifican en varios métodos según el tamaño de fragmento y las características de la secuencia, con un requisito común de usar enzimas herramienta. La PCR de solapamiento, basada en el método de ADN polimerasa, es simple y rápida en su operación. Los métodos BioBrick y BglBrick, que dependen de isosquimómeros, permiten una ensamblaje estandarizado, aunque el método BioBrick no es adecuado para proteínas de fusión. El método de clonación Golden Gate, basado en enzimas de restricción tipo IIS, permite una ligación eficiente sin marcas de múltiples fragmentos. El método de ensamblaje Gibson, que utiliza una combinación de múltiples enzimas herramienta, permite una ligación sin marcas con tamaños de fragmento que alcanzan varios cientos de kb. El diseño estandarizado de componentes de ADN mejora la tasa de utilización de fragmentos existentes.

Técnicas de ensamblaje in vivo

Aunque in vitro los fragmentos ensamblados pueden alcanzar varios cientos de kb de tamaño, a menudo el rendimiento es insuficiente, lo que requiere amplificación mediante organismos como Escherichia coli. Al ensamblar fragmentos que superan los 20 kb, a menudo se emplean sistemas recombinantes dentro de organismos, incluidos Bacillus subtilis, levadura y bacterias modificadas. La levadura, como huésped común, ha sido reconocida durante muchos años por su capacidad eficiente de recombinación homóloga. Puede utilizarse para ensamblar cromosomas artificiales de hasta varios megabases (Mb) de longitud. Además, Saccharomyces cerevisiae muestra una tolerancia extraordinaria a la longitud del cromosoma, proporcionando una base teórica para utilizar la levadura en la construcción de cromosomas ultra-largos en organismos superiores.

Aplicaciones

Yaohai Bio-Pharma emplea principalmente dos métodos de ensamblaje para la síntesis de genes: ensamblaje con ligasa y ensamblaje con polimerasa de ADN. El método de ensamblaje con ligasa conecta fragmentos de oligonucleótidos 5'-fosforilados que se superponen e hibridizan en ADN de doble cadena utilizando ligasa de ADN. El método de ensamblaje con polimerasa utiliza la polimerasa de ADN para extender los fragmentos de oligonucleótidos superpuestos mediante hibridación, obteniendo una mezcla de diferentes longitudes, y finalmente amplificando los fragmentos completos ensamblados exitosamente utilizando primers. Yaohai puede ayudar a los clientes a satisfacer requisitos específicos en la síntesis de genes.

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