Odhalení tajemství vysoce kvalitní extrakce plazmidu

Extrakce plazmidu je pro výzkumníky klíčová. Jako genové vektory jsou plazmidy životně důležité ve výzkumu vakcín a genové terapii, kde na kvalitě záleží. Mezi klíčové kvalitativní faktory patří podíl supercoiled a obsah endotoxinů. Předpisy se liší: FDA ≥ 80 %, SMPA ≥ 85 %, NMPA ≥ 90 %, s < 5 % lineární/otevřené kruhové DNA. Klienti často preferují ≥95% supercoiled. Hladiny endotoxinů jsou: výzkum (>50 EU/µg), transfekce (<50 EU/µg) a bez endotoxinu (<0.1 EU/µg).

Supercoiled Plasmid DNA

Plazmidy z Escherichia coli zahrnují supercoiled (SC), open-circulární (OC) a lineární (L) DNA. Vysoký podíl SC zvyšuje účinnost transfekce a expresi. Například transfekce plasmidu 85.45% SC je 2.5x vyšší a exprese HGF plasmidu 93.28% SC je 1.8x vyšší, což potvrzuje nadřazenost SC DNA.

Otevřená kruhová DNA: Když se zlomí jeden řetězec dvouvláknové DNA, nadšroubovicová struktura se uvolní a vytvoří otevřený kruhový plazmid s větším objemem, který migruje během elektroforézy nejpomaleji a je umístěn nahoře.

Lineární DNA: Když se oba řetězce plazmidové DNA zlomí, vytvoří se lineární struktura s relativně menším objemem, která migruje rychleji než DNA s otevřeným kruhem, ale pomaleji než superspirální DNA, umístěná na druhém místě.

Supercoiled DNA: Dvě šroubovice se proplétají a stáčejí se do superspirální struktury založené na šroubovici DNA. Má nejmenší objem a při elektroforéze migruje nejrychleji, je umístěn dole.

Kvantitativní analýza nadšroubovicové proporce

Laboratoře používají elektroforézu na agarózovém gelu (AGE) a analyzátor Gel-Pro k posouzení nadšroubovicové proporce pomocí elektroforézních snímků. Jeden obrázek ukazuje 97.539 % SC DNA, zatímco další ukazuje 63.833 % SC a 36.167 % OC DNA (lineární DNA není vidět).

Tajemství endotoxinu v plazmidech

Endotoxin je složka vnější vrstvy buněčné stěny gramnegativních bakterií, uvolněná po bakteriální smrti nebo lýze, obsahující toxický lipopolysacharid A. Během extrakce plazmidu endotoxin vstupuje do lyzačního roztoku, ovlivňuje účinnost transfekce a spouští nespecifické imunitní reakce, což vede k falešně pozitivním v experimentech.

Kvantitativní a kvalitativní analýza endotoxinu

Test Limulus amebocyte lysate (LAL) detekuje endotoxin prostřednictvím aglutinace s 2-keto-3-deoxyoktonovou kyselinou (KDO) v lipopolysacharidu (LPS). Je kvalitativní a semikvantitativní, což ukazuje na přítomnost endotoxinu prostřednictvím koagulace nebo změny barvy při smíchání se vzorky.

Yaohai Bio-Pharma nabízí superspirální plazmidy bez endotoxinů. Outsourcing společnosti Yaohai zvyšuje efektivitu transfekce a exprese. Dodávané plazmidy mají podíl ≥95 % SC (průměrně 85 %±10 %) a hladiny endotoxinů ≤0.1, ≤0.01 nebo ≤0.005 EU/μg.

Aktivně také hledáme institucionální nebo individuální globální partnery. Nabízíme nejkonkurenceschopnější kompenzaci v oboru. Máte-li jakékoli dotazy, neváhejte nás kontaktovat: [email protected]