Odemykání tajemství vysokokvalitní extrakce plazmidů

Extrakce plazmidu je klíčová pro výzkumníky. Jako genové vektory jsou plazmidy nezbytné v výzkumu vakcín a genové terapii, kde má význam kvalita. Důležité faktory kvality zahrnují podíl supercoilovaného DNA a obsah endotoxinů. Předpisy se liší: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, s <5% lineárním/otevřeně kruhovým DNA. Zákazníci často preferují ≥95% supercoilovaného DNA. Úrovně endotoxinů jsou: výzkum (>50 EU/µg), transfekce (<50 EU/µg) a bezendotoxinní (<0,1 EU/µg).

Supercoilované plazmové DNA

Plazmidy z Escherichia coli zahrnují supercoilované (SC), otevřeně kruhové (OC) a lineární (L) DNA. Vysoký podíl SC zvyšuje účinnost transfekce a expresi. Například transfekce plazmidu s 85,45% SC je 2,5krát vyšší a expresce HGF u plazmidu s 93,28% SC je 1,8krát vyšší, což potvrzuje převahu SC DNA.

Otevřeně-kruhová DNA: Když dojde k přerušení jedné vlákna dvojvlákné DNA, supercoilová struktura se uvolní a vytvoří otevřeně-kruhový plazmid s větším objemem, který během elektroforeze migruje nejpomaleji a nachází se nahoře.

Lineární DNA: Když dojde k přerušení obou vláken plazmidní DNA, vznikne lineární struktura s relativně menším objemem, která migruje rychleji než otevřeně-kruhová DNA, ale pomaleji než supercoilovaná DNA, nachází se na druhém místě.

Supercoilovaná DNA: Dvě helixy se propleťují a tvoří supercoilovanou strukturu založenou na DNA helixi. Má nejmenší objem a během elektroforeze migruje nejrychleji, nachází se dole.

Kvantitativní analýza podílu supercoilované DNA

Laboratoře používají agárové gelové elektroforezi (AGE) a Gel-Pro Analyzer k posouzení podílu supercoilované DNA pomocí elektroforetických obrázků. Jeden obrázek ukazuje 97,539 % SC DNA, zatímco druhý ukazuje 63,833 % SC DNA a 36,167 % OC DNA (lineární DNA není viditelná).

Tajemství endotoxinů v plazmidech

Endotoxiny jsou součástí vnější vrstvy buněčné stěny gramnegativních bakterií, které jsou uvolněny po bakteriální smrti nebo lysaci a obsahují toxické lipopolysacharidy A. Během extrakce plazmidu vstupují endotoxiny do lysisového roztoku, což ovlivňuje účinnost transfekce a vyvolává nespecifické imunitní reakce, vedoucí k falešně pozitivním výsledkům v experimentech.

Kvantitativní a kvalitativní analýza endotoxinů

Test Limulus amebocyte lysate (LAL) detekuje endotoxiny prostřednictvím aglutinace s 2-keto-3-deoxyoktonovou kyselinou (KDO) v lipopolysacharidech (LPS). Je to kvalitativní a semi-kvantitativní metoda, která indikuje přítomnost endotoxinů skrze srážení nebo změnu barvy po smíchání s vzorky.

Yaohai Bio-Pharma nabízí supercoilové plazmidy bez endotoxinů. Svěření práce Yaohai zvyšuje účinnost transfekce a expresní schopnosti. Dostavované plazmidy mají podíl ≥95% SC (průměr 85%±10%) a úroveň endotoxinů ≤0,1, ≤0,01 nebo ≤0,005 EU/μg.

Hledáme také aktivně globální partnery, jak institucionální, tak jednotlivce. Nabízíme nejvyšší odškodnění v odvětví. Pokud máte jakékoli otázky, neváhejte nás kontaktovat: [email protected]