Inovativní techniky sestavování pro rozsáhlou syntézu genů

Technologie montáže pro syntézu velkých fragmentů DNA od nuly je základním kamenem syntézy genů, která zahrnuje metody jako BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson Assembly, CPEC a Overlap PCR. Vzhledem k omezením současné technologie přesné syntézy DNA o délce genu v jediném kroku je nutné kombinovat techniky sestavení in vitro a in vivo pro sestavení fragmentů oligonukleotidů syntetizovaných v segmentech do dlouhých fragmentů DNA.

Techniky sestavení in vitro

Jsou klasifikovány do různých metod na základě velikosti fragmentu a sekvenční charakteristiky, se společným požadavkem na použití nástrojových enzymů. Overlap PCR, založená na metodě DNA polymerázy, je jednoduchá a rychlá. Metody BioBrick a BglBrick, které spoléhají na izoschizomery, umožňují standardizované sestavení, i když metoda BioBrick je pro fúzní proteiny nevhodná. Klonovací metoda Golden Gate, založená na restrikčních enzymech typu IIS, umožňuje účinnou bezproblémovou ligaci více fragmentů. Metoda sestavení Gibson, která využívá kombinaci více nástrojových enzymů, umožňuje bezproblémovou ligaci s velikostí fragmentů dosahující několika set kb. Standardizovaný design složek DNA zvyšuje míru využití existujících fragmentů.

Techniky sestavení in vivo

Ačkoli in vitro sestavené fragmenty mohou dosahovat velikosti několika set kb, výtěžek je často nedostatečný, což vyžaduje amplifikaci pomocí organismů, jako je např. Escherichia coli. Při sestavování fragmentů přesahujících 20 kb se často používají rekombinantní systémy v organismech, včetně Bacillus subtilis, kvasinek a upravených bakterií. Kvasinky, jako běžně používaný hostitel, byly po mnoho let uznávány pro svou účinnou homologní rekombinační schopnost. Může být použit k sestavení umělých chromozomů až do délky několika megabází (Mb). Saccharomyces cerevisiae navíc vykazuje mimořádnou toleranci k délce chromozomů, což poskytuje teoretický základ pro využití kvasinek ke konstrukci ultra dlouhých chromozomů ve vyšších organismech.

Aplikace

Yaohai Bio-Pharma primárně využívá dvě metody sestavení pro syntézu genů: sestavení ligázy a sestavení DNA polymerázy. Metoda sestavení ligázy spojuje překrývající se a hybridizované 5'-fosforylované oligonukleotidové fragmenty do dvouvláknové DNA pomocí DNA ligázy. Metoda sestavení polymerázy využívá DNA polymerázu k prodloužení překrývajících se oligonukleotidových fragmentů prostřednictvím hybridizace, získání směsi různých délek a nakonec amplifikace úspěšně sestavených fragmentů plné délky pomocí primerů. Yaohai's může pomoci klientům uspokojit specifické požadavky v genové syntéze.

Aktivně také hledáme institucionální nebo individuální globální partnery. Nabízíme nejkonkurenceschopnější kompenzaci v oboru. Máte-li jakékoli dotazy, neváhejte nás kontaktovat: [email protected]