Inovativní montážní techniky pro velkoformátovou syntézu genů

Technologie sestavování velkých DNA fragmentů od nuly je základem syntézy genů, zahrnující metody jako BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibsonova sestava, CPEC a Overlap PCR. V důsledku omezení současné technologie v přesné syntéze DNA délky genu jedním krokem je nutné kombinovat in vitro a in vivo sestavovací techniky pro sestavení oligonukleotidových fragmentů syntetizovaných částmi v dlouhé DNA.

In vitro sestavovací techniky

Dělí se do různých metod podle velikosti fragmentu a charakteristik posloupnosti, s běžným požadavkem na použití nástrojových enzymů. Overlap PCR, založená na metodě DNA polymerázy, je jednoduchá a rychlá v provozu. Metody BioBrick a BglBrick, které závisí na isoschizomerech, umožňují standardizovanou montáž, přestože metoda BioBrick není vhodná pro fúzní proteiny. Metoda Golden Gate klonování, založená na type IIS restrikčních enzymů, umožňuje efektivní bezšovnou ligaci více fragmentů. Metoda Gibsonovy montáže, která využívá kombinaci více nástrojových enzymů, umožňuje bezšovnou ligaci s velikostí fragmentů dosahující několik set kb. Standardizovaný design DNA komponent zvyšuje využití stávajících fragmentů.

Techniky in vivo montáže

I když... in vitro montované fragmenty mohou dosahovat velikosti několik set kb, často je však výnos nedostačující, což vyžaduje amplifikaci pomocí organismů jako jsou Escherichia coli. Při sestavování fragmentů déle než 20 kb se často používají rekombinační systémy u organismů, včetně Bacillus subtilis, kvasinek a geneticky upravených bakterií. Kvasinka jako běžně používaný hostitel je již po mnoho let známá pro svou účinnou schopnost homologní rekombinace. Může se použít k sestavení umělých chromozomů délky až několik megabáz (Mb). Navíc Saccharomyces cerevisiae ukazuje neobyčejnou tolerance k délce chromozomu, což poskytuje teoretické základy pro využití kvasinek při konstrukci ultra-dlouhých chromozomů u vyšších organismů.

Aplikace

Yaohai Bio-Pharma převážně používá dvě metody sestavování pro syntézu genu: ligazní sestavování a polymerázní sestavování. Ligazní metoda spojuje překrývající se a hybridizované 5'-fosforylované oligonukleotidové fragmenty do dvojitého DNA pomocí DNA ligazy. Polymerázní metoda využívá DNA polymerázu k rozšíření překrývajících se oligonukleotidových fragmentů prostřednictvím hybridizace, získává směs různých délek a nakonec amplifikuje úspěšně sestavené plné fragmenty pomocí primérů. Yaohai může pomoci klientům splnit jejich konkrétní požadavky v genech syntéze.

Hledáme také aktivně globální partnery, jak institucionální, tak jednotlivce. Nabízíme nejvyšší odškodnění v odvětví. Pokud máte jakékoli otázky, neváhejte nás kontaktovat: [email protected]