Giải mã Bí mật của Quy trình Chiết xuất Plasmid Chất lượng Cao

Việc chiết xuất plasmid rất quan trọng đối với các nhà nghiên cứu. Là vector gen, plasmid đóng vai trò then chốt trong nghiên cứu vắc xin và liệu pháp gen, nơi chất lượng là yếu tố quyết định. Các yếu tố chất lượng chính bao gồm tỷ lệ supercoiled và hàm lượng endotoxin. Quy định khác nhau: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, với <5% DNA tuyến tính/mở vòng. Khách hàng thường ưa chuộng ≥95% supercoiled. Mức độ endotoxin là: nghiên cứu (>50 EU/µg), chuyển nhiễm (<50 EU/µg), và không có endotoxin (<0.1 EU/µg).

DNA Plasmid Supercoiled

Plasmid từ Escherichia coli bao gồm DNA supercoiled (SC), mở vòng (OC) và tuyến tính (L). Tỷ lệ SC cao sẽ tăng cường hiệu quả chuyển nhiễm và biểu hiện. Ví dụ, plasmid có 85.45% SC có hiệu quả chuyển nhiễm cao hơn 2.5 lần, và plasmid có 93.28% SC có biểu hiện HGF cao hơn 1.8 lần, xác nhận sự ưu việt của DNA SC.

DNA hình tròn mở: Khi một chuỗi của DNA hai chuỗi bị đứt, cấu trúc siêu xoắn trở nên lỏng lẻo, tạo thành plasmid tròn mở có thể tích lớn hơn di chuyển chậm nhất trong quá trình điện泳 và được đặt ở trên cùng.

DNA tuyến tính: Khi cả hai chuỗi của DNA plasmid bị đứt, một cấu trúc tuyến tính hình thành, với thể tích tương đối nhỏ hơn di chuyển nhanh hơn DNA tròn mở nhưng chậm hơn DNA siêu xoắn, được đặt ở vị trí thứ hai.

DNA siêu xoắn: Hai helix quấn vào nhau, xoắn thành cấu trúc siêu xoắn dựa trên helix DNA. Nó có thể tích nhỏ nhất và di chuyển nhanh nhất trong quá trình điện泳, được đặt ở dưới cùng.

Phân tích định lượng tỷ lệ siêu xoắn

Các phòng thí nghiệm sử dụng điện di gel agarose (AGE) và Gel-Pro Analyzer để đánh giá tỷ lệ siêu xoắn thông qua hình ảnh điện di. Một hình ảnh cho thấy 97,539% DNA SC, trong khi hình ảnh khác cho thấy 63,833% DNA SC và 36,167% DNA OC (DNA tuyến tính không nhìn thấy được).

Bí mật của endotoxin trong plasmid

Endotoxin là thành phần của lớp ngoài màng tế bào vi khuẩn Gram âm, được giải phóng sau khi vi khuẩn chết hoặc phân hủy, chứa lipopolysaccharide A có tính độc. Trong quá trình chiết xuất plasmid, endotoxin xâm nhập vào dung dịch phân hủy, ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen và kích hoạt phản ứng miễn dịch không đặc hiệu, dẫn đến kết quả sai dương trong thí nghiệm.

Phân tích Định lượng và Định tính Endotoxin

Kiểm tra Limulus amebocyte lysate (LAL) phát hiện endotoxin thông qua sự ngưng tụ với axit 2-keto-3-deoxyoctonic (KDO) trong lipopolysaccharide (LPS). Phương pháp này là định tính và bán định lượng, chỉ ra sự hiện diện của endotoxin thông qua đông đặc hoặc thay đổi màu sắc khi trộn lẫn với mẫu.

Yaohai Bio-Pharma cung cấp plasmid siêu cuộn không chứa endotoxin. Việc hợp tác với Yaohai sẽ tăng cường hiệu suất chuyển gen và biểu hiện. Các plasmid được cung cấp có tỷ lệ ≥95% dạng SC (trung bình ±10%) và mức độ endotoxin ≤0.1, ≤0.01, hoặc ≤0.005 EU/μg.

Chúng tôi cũng đang tích cực tìm kiếm đối tác toàn cầu là tổ chức hoặc cá nhân. Chúng tôi cung cấp mức bồi thường cạnh tranh nhất trong ngành. Nếu bạn có bất kỳ câu hỏi nào, xin vui lòng liên hệ với chúng tôi: [email protected]