Chuẩn bị mRNA IVT

Phiên mã trong ống nghiệm (IVT) là phương pháp được ưa chuộng để chuẩn bị mRNA, có khả năng tạo ra microgam đến miligam mRNA ở quy mô phòng thí nghiệm. Đối với mục đích nghiên cứu, các nhà cung cấp thuốc thử đã phát triển các hệ thống phản ứng IVT đa năng phù hợp với mRNA có độ dài vừa phải (1000-4000 nucleotide).

Trong bài viết này, chúng tôi sẽ tóm tắt quá trình phiên mã in vitro (IVT) của mRNA, bao gồm hệ thống phản ứng IVT thông thường được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm và hệ thống phản ứng IVT phù hợp với mRNA cực dài (>9000 nucleotide).

Bộ dụng cụ cho phép đóng nắp đồng phiên mã với CleanCap AG và giảm khả năng sinh miễn dịch với m1ψ. DNase I loại bỏ DNA còn sót lại. Năng suất thấp có thể do trộn kém, oxy hóa thuốc thử hoặc các vấn đề về khuôn mẫu DNA, có thể được giảm thiểu bằng cách ly tâm, thuốc thử mới, kiểm soát và điều chỉnh lượng khuôn mẫu/thời gian phản ứng.

Yaohai Bio-Pharma cung cấp nhiều sản phẩm RNA IVT chế tạo sẵn (bột lỏng/đông khô) và các sản phẩm thành phẩm LNP, mã hóa các protein như protein huỳnh quang (eGFP, mCHERRY), luciferase, recombinase Cre và kháng nguyên OVA, để đáp ứng các nhu cầu thử nghiệm hoặc dự án khác nhau.

Hệ thống IVT cho mRNA siêu dài

IVT thông thường có thể không hiệu quả đối với mRNA quá dài (>9000 nt). Cần có sự hiểu biết sâu sắc và điều chỉnh hợp lý các thành phần IVT.

Mẫu DNA: Plasmid tuyến tính hóa hoặc sản phẩm PCR có trình tự khởi động tương ứng, hòa tan trong H2O không có RNase. Nồng độ khuôn DNA cao hơn 40 nM được khuyến nghị cho điều kiện IVT tối ưu.

ĐTT: Duy trì hoạt động của enzyme trong quá trình phiên mã. Nên thêm DTT tươi vào đệm phản ứng để có hoạt động tối ưu của enzyme.

Chất ức chế RNase: Ức chế hoạt động của RNase và duy trì sự ổn định của mRNA.

RNA polymerase T7: Xúc tác phiên mã DNA thành RNA, tương ứng với trình tự khởi động. Hoạt động của T7 RNA polymerase bị ảnh hưởng bởi pH và ion magiê.

Ion Magiê (Mg2+): Một cofactor cho RNA polymerase. Nồng độ quá thấp làm giảm hiệu quả phiên mã, trong khi nồng độ quá cao dẫn đến sự thoái hóa RNA. [Mg2+] tự do nên được điều chỉnh dựa trên nồng độ nucleotide. Mỗi nucleotide tạo phức với một [Mg2+], do đó nồng độ [Mg2+] phải vượt quá nồng độ nucleotide tổng thể.

Nucleoside Triphosphate (NTP): Là chất nền, NTP là đơn vị cơ bản của RNA. Nồng độ NTP trên 7 mM có tác động tích cực đến sản xuất mRNA.

Spermidine: Ổn định phức hợp DNA-enzyme và kích thích phản ứng phiên mã; tuy nhiên, nồng độ quá cao có tác dụng ức chế. Nồng độ spermidine được khuyến nghị là từ 1 đến 3 mM.

Pyrophosphatase vô cơ (PPase): Được thêm vào phản ứng IVT để ngăn ngừa sự tích tụ các ion pyrophosphate vô cơ (PPi), tránh sự tạo phức của chúng với Mg2+ và đảm bảo đủ Mg2+ tự do.

Tận dụng công nghệ tiên phong và kinh nghiệm về mRNA IVT, Yaohai Bio-Pharma cung cấp dịch vụ RNA IVT trọn gói, bao gồm thiết kế trình tự, chuẩn bị RNA IVT (với mod m1ψ), tạo vòng RNA, tinh chế, sấy đông, đóng gói LNP và thử nghiệm chất lượng.

Chúng tôi cũng đang tích cực tìm kiếm các đối tác toàn cầu là tổ chức hoặc cá nhân. Chúng tôi cung cấp mức bồi thường cạnh tranh nhất trong ngành. Nếu bạn có bất kỳ câu hỏi nào, xin vui lòng liên hệ với chúng tôi: [email protected]