Chuẩn bị mRNA IVT

Chuyển bản thể外 (IVT) là phương pháp được ưa chuộng để chuẩn bị mRNA, có khả năng sản xuất từ microgam đến miligam mRNA trên quy mô phòng thí nghiệm. Đối với mục đích nghiên cứu, các nhà cung cấp hóa chất đã phát triển các hệ thống phản ứng IVT linh hoạt phù hợp cho mRNA có độ dài trung bình (1000-4000 nucleotides).

Trong bài viết này, chúng tôi sẽ tóm tắt quá trình chuyển bản mRNA thể外 (IVT), bao gồm hệ thống phản ứng IVT truyền thống được sử dụng trên quy mô phòng thí nghiệm và hệ thống phản ứng IVT phù hợp cho mRNA siêu dài (>9000 nucleotides).

Các bộ试剂 cho phép gắn mũ đồng thời với CleanCap AG và giảm tính miễn dịch với m1ψ. DNase I loại bỏ DNA dư thừa. Sản lượng thấp có thể do trộn không đều, hóa chất bị oxi hóa, hoặc vấn đề về mẫu DNA, điều này có thể được khắc phục bằng cách ly tâm, sử dụng hóa chất mới, kiểm soát và điều chỉnh lượng mẫu DNA/thời gian phản ứng.

Yaohai Bio-Pharma cung cấp các sản phẩm RNA IVT sẵn có (dạng lỏng/bột đông khô) và các sản phẩm LNP hoàn chỉnh, mã hóa các protein như protein phát sáng (eGFP, mCHERRY), luciferase, recombinase Cre và kháng nguyên OVA, để đáp ứng các nhu cầu thí nghiệm hoặc dự án khác nhau.

Hệ thống IVT cho mRNA siêu dài

IVT thông thường có thể không hiệu quả đối với mRNA quá dài (>9000 nt). Cần có sự hiểu biết sâu sắc và điều chỉnh hợp lý các thành phần của IVT.

Mẫu DNA: Plasmid tuyến tính hoặc sản phẩm PCR có chứa chuỗi promoter tương ứng, được hòa tan trong dung dịch H2O không RNase. Nồng độ mẫu DNA cao hơn 40 nM được khuyến nghị để đạt điều kiện IVT tối ưu.

DTT: Duy trì hoạt động enzym trong quá trình phiên mã. Nên thêm DTT tươi vào buffer phản ứng để đảm bảo hoạt động enzym tối ưu.

Ngăn chặn hoạt động của RNase và duy trì sự ổn định của mRNA. Ức chế hoạt động của RNase và duy trì sự ổn định của mRNA.

Enzym T7 RNA Polymerase: Kích thích quá trình phiên mã DNA thành RNA, tương ứng với dãy trình tự promoter. Hoạt động của polymerase RNA T7 bị ảnh hưởng bởi pH và ion magie.

Ion Magie (Mg2+): Một cofactor cho polymerase RNA. Nồng độ quá thấp sẽ làm giảm hiệu suất phiên mã, trong khi nồng độ quá cao có thể dẫn đến sự phân hủy RNA. [Mg2+] tự do cần được điều chỉnh dựa trên nồng độ nucleotide. Mỗi nucleotide kết hợp với một [Mg2+], vì vậy nồng độ [Mg2+] cần vượt quá tổng nồng độ nucleotide.

Nucleoside Triphosphates (NTP): Là substrat, NTPs là đơn vị cơ bản của RNA. Nồng độ NTP trên 7 mM có tác động tích cực đến việc sản xuất mRNA.

Spermidine: Ổn định hóa các phức hợp DNA-enzym và kích thích phản ứng phiên mã; tuy nhiên, nồng độ quá cao có thể gây ức chế. Nồng độ spermidine khuyến nghị nằm trong khoảng từ 1 đến 3 mM.

Pyrophosphatase vô cơ (PPase): Được thêm vào các phản ứng IVT để ngăn chặn sự tích tụ của ion pyrophosphate vô cơ (PPi), tránh việc chúng tạo phức với Mg2+ và đảm bảo có đủ Mg2+ tự do.

Bằng cách tận dụng công nghệ tiên phong và kinh nghiệm về mRNA IVT, Yaohai Bio-Pharma cung cấp dịch vụ RNA IVT trọn gói, bao gồm thiết kế chuỗi, chuẩn bị RNA IVT (với sửa đổi m1ψ), cyclization RNA, tinh chế, sấy đông, bao bọc LNP và kiểm tra chất lượng.

Chúng tôi cũng đang tích cực tìm kiếm đối tác toàn cầu là tổ chức hoặc cá nhân. Chúng tôi cung cấp mức bồi thường cạnh tranh nhất trong ngành. Nếu bạn có bất kỳ câu hỏi nào, xin vui lòng liên hệ với chúng tôi: [email protected]