Оптимізація цілісності клітин E. coli для виробництва Biopharma

У галузі біофармацевтики Escherichia coli (E. coli) відіграє життєво важливу роль як хазяїн для експресії рекомбінантних білків. Клітинна цілісність E. coli має вирішальне значення для виходу білка, якості та витрат на виробництво. Ця цілісність насамперед стосується структури та функції внутрішньої мембрани (IM) і зовнішньої мембрани (OM).

Yaohai Bio-Pharma 15 років займається ферментацією E. coli та експресією рекомбінантного білка. Ми використовуємо різні стратегії для підтримки високої цілісності клітин E. coli, вихід плазміди перевищує 1 г/л протягом 30-годинного циклу культивування. Спираючись на великий досвід мікробної експресії, Yaohai Bio-Pharma узагальнила кілька ефективних стратегій моніторингу та покращення клітинної цілісності кишкової палички під час біофармацевтичного виробництва.

Методи моніторингу цілісності клітин E. coli

Проточна цитометрія: використовує флуоресцентні барвники для диференціації клітинних станів, наприклад йодид пропідію для визначення життєздатності клітин і SYTO9 для оцінки проникності ОМ. Однак це вимагає великої вартості плям і складних операцій.

Колориметричні методи: відображення лізису клітин шляхом виявлення вмісту ДНК, активності ферментів тощо в надосадовій рідині, наприклад використання набору реагентів PicoGreen і аналізів активності лужної фосфатази. Ці методи, однак, громіздкі і вимагають дорогих реагентів.

Високоефективна рідинна хроматографія: використовується для автономного виявлення концентрації позаклітинного продукту для оцінки витоку ОВ. Проте його автоматизація складна, а аналіз тривалий.

Методи вібраційної спектроскопії: такі як ближня інфрачервона та середня інфрачервона спектроскопія, які мають потенційні застосування, але вимагають подолання спектральних перешкод і проблем аналізу даних.

Діелектрична спектроскопія: оцінює цілісність мембрани шляхом вимірювання імпедансу клітинних суспензій, що дозволяє здійснювати онлайн-моніторинг у реальному часі. Однак він чутливий до перешкод, і калібрування є складним.

Біосенсори: можуть виявляти сполуки, що витікають із клітин або периплазми, але стикаються з такими проблемами, як труднощі регенерації сенсора.

Вимірювання в'язкості та щільності: низька вартість і швидкий аналіз, але недостатня вибірковість і вимагають розгляду даних кількох партій для оцінки.

Фактори, що впливають на цілісність клітин

Інженерія штамів: змінює цілісність ОМ за допомогою генної інженерії, наприклад мутації генів ліпопротеїнів, але може впливати на ріст штамів.

Індукований стрес: надмірна експресія рекомбінантних білків призводить до метаболічного навантаження, що впливає на клітинну фізіологію. Тому необхідне розумне регулювання рівнів експресії.

Швидкість подачі субстрату: як надмірно висока, так і низька швидкість подачі впливає на лізис клітин і цілісність ОВ.

Температура та аерація: високі температури та низька доступність кисню збільшують стрес експресії та витік ОВ відповідно, але конкретні ефекти відрізняються.

Осмотики: використовуються для вивільнення периплазматичних білків, але пошкоджують життєздатність клітин, обмежуючи їх застосування.

Висновок Майбутні дослідження потребують глибшого вивчення механізмів та умов відновлення мембран, щоб точно контролювати цілісність клітинної мембрани. Очікується, що оптимізація методів моніторингу та аналіз впливових факторів підвищить якість продукції, що сприятиме розвитку біофармацевтичної промисловості.

Ми також активно шукаємо інституційних або індивідуальних глобальних партнерів. Ми пропонуємо найконкурентнішу компенсацію в галузі. Якщо у вас виникли запитання, зв’яжіться з нами за адресою [email protected]