Припрема на IVT mRNA

Транскрипцијата во vitro (IVT) е предпочитениот метод за приготвување на mRNA, што може да произведе микрограми до милиграми mRNA на лабораторна скала. За истражувачки цели, производите на реактиви го развијаат многу функционален IVT систем за реакции кој е пригоден за mRNA со умерена должина (1000-4000 нуклеотиди).

Во овој чланок ќе го сумираме процесот на транскрипција во vitro (IVT) на mRNA, вклучувајќи и конвенционалниот IVT реактивен систем користен на лабораторна скала, како и IVT систем кој е пригоден за свршено долг mRNA (>9000 нуклеотиди).

Сетовите дозволуваат ко-транскрипционо капирање со CleanCap AG и се намалува имуногеноста со m1ψ. DNase I ја премахнува остатната DNA. Ниска добивкa може да биде резултат од лоша мешавање, оксидација на реактивите или проблеми со DNA темплот, што може да се надмине со центрифугирање, свежи реактиви, контроли и правење на поправки во количината на темплот/времето за реакција.

Yaohai Bio-Pharma нуди различни предизработени IVT RNA производи (течност/замрзнат порошок) и ЛНП завршен производ, кои кодираат белци како флуоресентни белци (eGFP, mCHERRY), луцифераза, рекомбиназа Cre и антиген OVA, за да задоволат различните експериментални или проектни потреби.

IVT систем за ултра-дугоден mRNA

Обичната IVT можеби не работи за премногу дуги mRNA (>9000 нт). Потребна е длабока разбирање и рационална прилагодување на IVT компонентите.

DNA Темплет: Линеаризирани плазмиди или ПЦР производи со одговарачки промоторски низови, растворени во RNase-свободна H2O. Препорачува се концентрација на DNA темплет поголема од 40 нМ за оптимални IVT услови.

DTT: Одржува ензимска активност токму што се врши транскрипцијата. Свеж DTT треба да се додаде во реакциониот буфер за оптимална ензимска активност.

RNase Инхибитор: Инхибира RNase активност и оdrжува стабилноста на mRNA.

T7 RNA Полимераза: Катализира транскрипција на ДНК во РНК, според секвенцата на промоторот. Активноста на Т7 РНК полимеразата е повлијана од pH и магnezijумски иони.

Магnezijумски Иони (Mg2+): Кофаktor за РНК полимеразата. Премалите концентрации смануваат ефикасноста на транскрипцијата, додека превисоките концентрации водат до деградација на РНК. Слободниот [Mg2+] треба да се прилагоди според концентрацијата на нуклеотидите. Секој нуклеотид челира еден [Mg2+], па затоа концентрацијата на [Mg2+] треба да надминува вкупната концентрација на нуклеотидите.

Нуклеозид Трифосфати (NTP): Како субстрати, NTP-тес се основните единици на РНК. Концентрациите на NTP над 7 mM имаат позитивен утицај врз производството на мРНК.

Спермидин: Стабилизира ДНК-ензим комплексите и стимулира транскрипцијските реакциите; меѓутоа, превисоките концентрации имаат инхибиција. Препорачливата концентрација на спермидин е помеѓу 1 и 3 mM.

Инорганички Пирофосфатаза (PPase): Додадени во реакциите на IVT за да се спречи натрукувањето на инорганичните иони пирофосфат (PPi), со што се избегнува техната хелација со Mg2+ и се осигура доволно слободен Mg2+.

Со користење на пионерска технологија и искуство од IVT mRNA, Yaohai Bio-Pharma нуди комплетна услуга за IVT RNA, која вклучува дизајн на низа, припрема на IVT RNA (со модификациите m1ψ), циклација на RNA, чистење, заморавање, енкапсулирање во LNP и тестiranje на квалитет.

Така исто активно бареме глобални партнери од институции или индивидууми. Нудиме најконкурентниот компензација во индустријата. Ако имате било кои прашања, не се колебајте да се обидете да ни kontaktirate: [email protected]