Подготовка на IVT mRNA

Ин витро транскрипцијата (IVT) е префериран метод за подготовка на mRNA, способна да даде микрограми до милиграми mRNA на лабораториско ниво. За истражувачки цели, добавувачите на реагенси развија разновидни системи за IVT реакција погодни за mRNA со умерена должина (1000-4000 нуклеотиди).

Во оваа статија, ќе ја сумираме ин витро транскрипцијата (IVT) на mRNA, вклучувајќи го и конвенционалниот систем за реакција на IVT што се користи на лабораториско ниво и системот за реакција IVT погоден за ултра долга mRNA (> 9000 нуклеотиди).

Комплетите овозможуваат ко-транскрипциско ограничување со CleanCap AG и ја намалуваат имуногеноста со m1ψ. DNase I ја отстранува резидуалната ДНК. Нискиот принос може да се должи на лошо мешање, оксидација на реагенсот или проблеми со шаблонот на ДНК, што може да се ублажи со центрифугирање, свежи реагенси, контроли и прилагодување на количината на шаблонот/времето на реакција.

Yaohai Bio-Pharma обезбедува различни префабрикувани IVT RNA производи (течен / сушен во замрзнување прашок) и готови производи LNP, кодирање на протеини како што се флуоресцентни протеини (eGFP, mCHERRY), луцифераза, рекомбиназа Cre и антиген OVA, за да се исполнат различни експериментални или проектни потреби.

IVT систем за ултра долга mRNA

Конвенционалната IVT може да не работи за премногу долга mRNA (>9000 nt). Потребно е длабоко разбирање и рационално прилагодување на IVT компонентите.

Шаблон за ДНК: Линеаризирани плазмиди или PCR производи со соодветните промоторни секвенци, растворени во H2O без RNase. Се препорачува концентрација на шаблон на ДНК повисока од 40 nM за оптимални IVT услови.

ДТТ: Ја одржува ензимската активност за време на транскрипцијата. Свеж ДТТ треба да се додаде во реакциониот пуфер за оптимална ензимска активност.

Инхибитор на RNase: Ја инхибира активноста на RNase и ја одржува стабилноста на mRNA.

Т7 РНК полимераза: Ја катализира транскрипцијата на ДНК во РНК, што одговара на промоторската секвенца. Активноста на Т7 РНК полимеразата е под влијание на pH и јони на магнезиум.

Магнезиумови јони (Mg2+): Кофактор за РНК полимераза. Премалите концентрации ја намалуваат ефикасноста на транскрипцијата, додека превисоките концентрации доведуваат до деградација на РНК. Слободниот [Mg2+] треба да се прилагоди врз основа на концентрацијата на нуклеотид. Секој нуклеотид хелатира еден [Mg2+], така што концентрацијата [Mg2+] треба да ја надмине вкупната концентрација на нуклеотид.

Нуклеозидни трифосфати (NTP): Како супстрати, НТП се основните единици на РНК. Концентрациите на NTP над 7 mM имаат позитивно влијание врз производството на mRNA.

Спермидин: Ги стабилизира ДНК-ензимските комплекси и ги стимулира реакциите на транскрипција; сепак, прекумерните концентрации имаат инхибиторни ефекти. Препорачаната концентрација на спермидин е помеѓу 1 и 3 mM.

Неорганска пирофосфатаза (PPase): Додадено во IVT реакциите за да се спречи акумулација на неоргански пирофосфатни јони (PPi), избегнувајќи ја нивната хелација со Mg2+ и обезбедувајќи доволно слободен Mg2+.

Искористувајќи ја пионерската технологија и искуството со IVT mRNA, Yaohai Bio-Pharma обезбедува едношалтерска услуга IVT RNA, која опфаќа дизајн на секвенца, подготовка на IVT RNA (со m1ψ модови), цикализација на RNA, прочистување, сушење со замрзнување, LNP инкапсулација и тестирање на квалитетот.

Исто така, активно бараме институционални или индивидуални глобални партнери. Ние нудиме најконкурентна компензација во индустријата. Ако имате какви било прашања, ве молиме слободно контактирајте не: [email protected]