Karakterisasi mRNA 3' poli(A).
Karakterisasi mRNA 3' poli(A).
Ekor 3' poli(A) (poliadenosin) mRNA merupakan bagian integral dari regulasi pasca transkripsional, yang memengaruhi ekspor, stabilitas, dan translasi mRNA. Dalam kasus mRNA yang ditranskripsi secara in vitro (IVT), ekor poli(A) dimasukkan selama ko-transkripsi dengan cara yang sudah ditemplat atau melalui proses tailing enzimatik dengan cara yang tidak ditempelkan. Poli(A) 3′ ini berfungsi sebagai atribut kualitas kritis (CQA) untuk RNA IVT, sehingga memerlukan karakterisasi menyeluruh selama pengembangan proses dan pelepasan batch.
Yaohai Bio-Pharma menyediakan layanan karakterisasi 3' poli(A) khusus, menggunakan teknik seperti pembelahan ribonuklease T1 (RNase T1), kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik pasangan ion (IP-RP-HPLC)/kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), dan analisis data yang komprehensif.
Persyaratan Peraturan untuk Karakterisasi mRNA 3' poli(A).
Menurut pertimbangan peraturan WHO, “integritas struktur mRNA dianggap sebagai atribut kualitas penting untuk pelepasan mRNA. Oleh karena itu, kontrol diperlukan untuk integritas mRNA, efisiensi pembatasan 5′, keberadaan atau panjang ekor poli(A) 3′, dan seterusnya.”
Metode Analisis
Analisis | metode |
karakterisasi mRNA 3' poli(A). | LC-MS setelah pencernaan |
Prosedur
Langkah 1. Pembelahan RNase T1
Analisis langsung mRNA utuh full-length oleh LC-MS tidak praktis karena ukuran dan heterogenitasnya. Untuk memeriksa ekor poli(A), ekor tersebut harus dibelah dari mRNA berukuran penuh. Metode yang lazim melibatkan pencernaan enzimatik dengan RNase T1, secara selektif membelah ujung 3′ rG sambil mempertahankan urutan poli(A). Sampel mRNA mengalami pencernaan dengan RNase T1, dan fragmen pembelahan yang mengandung regangan poli(A) diisolasi menggunakan manik magnetik berlapis oligo dT.
Langkah 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Ekor yang diekstraksi menjalani analisis menggunakan LC-MS, memberikan informasi panjang ekor yang tepat pada resolusi nukleotida tunggal. Dalam analisis oligonukleotida LC-MS, pemisahan fase terbalik pasangan ion (IP-RP) dengan aditif fase gerak amina merupakan mode kromatografi yang disukai, karena daya penyelesaiannya yang kuat dan kompatibilitas dengan spektrometri massa (MS).
Langkah 3. Analisis data
Panjang ekor poli(A) dan kelimpahan relatifnya bergantung pada jumlah dan intensitas puncak dibagi massa adenosin. Setelah memproses atau mendekonvolusi spektrum massa, massa yang diantisipasi dari ekor poli(A) 100-mer (33,163 Da dalam kotak) diketahui, disertai dengan serangkaian massa yang berjarak 329 sma, setara dengan massa adenosin (A) .
Kasus Karakterisasi 3' poli(A) dengan LC–MS
Yaohai-BioPharma telah mengembangkan metode yang kuat untuk karakterisasi mRNA 3' poli(A), termasuk pembelahan RNase T1 dan IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma telah mengembangkan metode yang kuat untuk karakterisasi mRNA 3' poli(A), termasuk pembelahan RNase T1 dan IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
