Efisiensi pembatasan mRNA 5'
Pentingnya Analisis Efisiensi mRNA 5'capping
Struktur tutup yang terletak di ujung 5′ mRNA memainkan peran penting dalam penerjemahan, stabilisasi, dan transportasi mRNA yang efisien dalam eukariota. Dalam konteks mRNA in vitro-transscribed (IVT), tutup 5' dimasukkan melalui proses pembatasan kotranskripsional atau pembatasan enzimatik. Sebagai komponen IVT RNA yang sangat diperlukan, tutup 5′ berdiri sebagai atribut kualitas kritis (CQA) yang memerlukan karakterisasi komprehensif selama pengembangan proses dan pelepasan batch.
Yaohai-Bio Pharma menyediakan solusi analisis efisiensi pembatasan 5' yang komprehensif, mencakup desain belat oligonukleotida (probe), pembelahan RNase H, kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik pasangan IP-RP-Ion (IP-RP-HPLC)/kromatografi cair -spektrometri massa (LC-MS), analisis data.
Persyaratan Peraturan untuk integritas mRNA
Menurut pertimbangan peraturan WHO, “integritas struktur mRNA dianggap sebagai atribut kualitas penting untuk pelepasan mRNA. Oleh karena itu, kontrol diperlukan untuk integritas mRNA, efisiensi pembatasan 5′, keberadaan atau panjang ekor poli(A) 3′, dan seterusnya.”
Metode Analisis
Analisis |
metode |
Efisiensi pembatasan mRNA 5' |
LC-MS setelah pencernaan |
Prosedur
Langkah 1. Desain belat oligonukleotida (probe).
Probe pembelahan, yang menggabungkan 2'-O-metilnukleotida dan tetradeoksiribonukleotida, berfungsi untuk membelah untai RNA komplementer pada posisi tertentu ketika ada RNase H. Metode ini terbukti sangat bermanfaat untuk menghasilkan fragmen RNA yang lebih besar yang ditargetkan.
Langkah 2. Pembelahan RNase H
Sebuah probe yang terbiotinilasi, dirancang secara strategis untuk melengkapi ujung 5' mRNA, diterapkan bersama dengan RNase H untuk mengkatalisis pembelahan target oligonukleotida ujung 5' yang memiliki struktur penutup.
Langkah 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Dalam analisis oligonukleotida LC-MS, mode kromatografi yang disukai adalah pemisahan fase terbalik pasangan ion (IP-RP) menggunakan aditif fase gerak amina. Hal ini disebabkan oleh daya penyelesaiannya yang unggul dan kompatibilitasnya dengan spektrometri massa (MS).
Langkah4. Analisis data
Massa berbeda yang diamati pada fragmen pembelahan yang dilengkapi tutup m7GpppG, berbeda dengan massa yang memiliki tutup G difosfat, trifosfat, atau tidak termetilasi (GpppG), memudahkan identifikasinya dan memungkinkan estimasi efisiensi pembatasan.
Kasus pembatasan analisis efisiensi dengan LC – MS
Yaohai-Bio Pharma telah mengembangkan metode yang kuat untuk analisis efisiensi pembatasan mRNA, mulai dari desain belat oligonukleotida (probe), pembelahan RNase H, IP-RP-HPLC/LC-MS hingga analisis data.
Kromatogram ion total (kiri) dan spektrum massa elektrospray (kanan) dari fragmen belahan ujung 5'
EN
