mRNS 3' poli(A) jellemzése
mRNS 3' poli(A) jellemzése
Az mRNS 3' poli(A) farka (poliadenozinok) a poszttranszkripciós szabályozás szerves része, befolyásolva az mRNS exportját, stabilitását és transzlációját. Az in vitro átírt (IVT) mRNS-ek esetében a poli(A) farok vagy ko-transzkripció során templált módon, vagy enzimatikus farokképző folyamaton keresztül, nem templált módon kerül bejutásra. Ez a 3′ poli(A) kritikus minőségi attribútumként (CQA) szolgál az IVT RNS-ek számára, ami alapos jellemzést tesz szükségessé mind a folyamatfejlesztés, mind a tételek kiadása során.
A Yaohai Bio-Pharma speciális 3' poli(A) karakterizálási szolgáltatásokat nyújt, olyan technikákat alkalmazva, mint a ribonukleáz T1 (RNáz T1) hasítás, ionpáros fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (IP-RP-HPLC)/folyadékkromatográfia-tömegspektrometria. (LC-MS) és átfogó adatelemzés.
Az mRNS 3' poli(A) jellemzésére vonatkozó szabályozási követelmények
A WHO szabályozási megfontolásai szerint „az mRNS szerkezetének integritását az mRNS felszabadulásának kritikus minőségi jellemzőjének tekintik. Ezért ellenőrzésre van szükség az mRNS integritásához, az 5′-es capping hatékonyságához, a 3′-os poli(A) farok jelenlétéhez vagy hosszához és így tovább.
Analitikai módszer
Elemzés |
Mód |
mRNS 3' poli(A) jellemzése |
LC-MS emésztés után |
Eljárás
1. lépés: RNáz T1 hasítás
A teljes hosszúságú intakt mRNS LC-MS-sel történő közvetlen analízise mérete és heterogenitása miatt nem praktikus. A poli(A) farok vizsgálatához le kell hasítani a teljes hosszúságú mRNS-ről. Az elterjedt módszer az RNáz T1 enzimes emésztését foglalja magában, amely szelektíven hasítja az rG 3'-végét, miközben megőrzi a poli(A) szekvenciát. Az mRNS-mintát RNáz T1-gyel emésztjük, és a poli(A) szakaszokat tartalmazó hasítási fragmentumokat oligo dT-bevonatú mágneses gyöngyök segítségével izoláljuk.
2. lépés: IP-RP-HPLC/LC-MS
A kivont farkakat LC-MS segítségével analízisnek vetették alá, amely pontos farokhossz-információt kínál egyetlen nukleotid felbontással. Az oligonukleotid LC-MS analízisben az amin-mozgófázisú adalékanyagokkal végzett ionpáros fordított fázisú (IP-RP) elválasztás az előnyben részesített kromatográfiás mód, robusztus feloldóképességük és tömegspektrometriával (MS) való kompatibilitásuk miatt.
3. lépés Adatelemzés
A poli(A) farok hossza és relatív bősége a csúcsok számától és intenzitásától függ, osztva az adenozin tömegével. A tömegspektrum feldolgozása vagy dekonvolúciója során a 100 tagból álló poli(A) farok várható tömege (33,163 329 Da a dobozban) felismerhető, amelyet XNUMX amu távolságra elhelyezett tömegsorozat kísér, amely megfelel az adenozin (A) tömegének. .
A 3' poli(A) jellemzése LC–MS-sel
A Yaohai-BioPharma robusztus módszert fejlesztett ki az mRNS 3' poli(A) jellemzésére, beleértve az RNáz T1 hasítást és az IP-RP-HPLC/LC-MS-t.
A Yaohai-BioPharma robusztus módszert fejlesztett ki az mRNS 3' poli(A) jellemzésére, beleértve az RNáz T1 hasítást és az IP-RP-HPLC/LC-MS-t.
EN
