mRNS 5'-lezárási hatékonyság
Az mRNS 5' capping hatékonysági elemzésének jelentősége
Az mRNS 5′ végén található kupakszerkezet kulcsfontosságú szerepet játszik az mRNS-ek hatékony transzlációjában, stabilizálásában és szállításában az eukariótákon belül. Az in vitro transzkripciós (IVT) mRNS összefüggésében az 5'-sapkát vagy ko-transzkripciós vagy enzimatikus capping-eljárással vezetik be. Az IVT RNS-ek nélkülözhetetlen összetevőjeként az 5′-es sapka kritikus minőségi jellemzőként (CQA) áll, amely átfogó jellemzést tesz szükségessé a folyamatfejlesztés és a kötegelt kiadás során.
A Yaohai-Bio Pharma átfogó 5'-sapkázási hatékonyságelemző megoldásokat kínál, amelyek magukban foglalják az oligonukleotid sín (próba) tervezését, az RNáz H hasítást, az IP-RP-Ionpáros fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (IP-RP-HPLC)/folyadékkromatográfiát. -tömegspektrometria (LC-MS), adatelemzés.
Az mRNS integritására vonatkozó szabályozási követelmények
A WHO szabályozási megfontolásai szerint „az mRNS szerkezetének integritását az mRNS felszabadulásának kritikus minőségi jellemzőjének tekintik. Ezért ellenőrzésre van szükség az mRNS integritásához, az 5′-es capping hatékonyságához, a 3′-os poli(A) farok jelenlétéhez vagy hosszához és így tovább.
Analitikai módszer
Elemzés | Mód |
mRNS 5'-lezárási hatékonyság | LC-MS emésztés után |
Eljárás
1. lépés: Oligonukleotid sínek (próba) tervezése
A 2'-O-metil-nukleotidokat és tetradezoxiribonukleotidokat tartalmazó hasítási próba arra szolgál, hogy egy komplementer RNS-szálat hasítson specifikus pozíciókban, amikor RNáz H jelen van. Ez a módszer rendkívül értékesnek bizonyul nagyobb RNS-fragmensek célzott generálásához.
2. lépés: RNáz H hasítás
Egy biotinilezett próbát, amelyet stratégiailag úgy terveztek, hogy komplementer legyen az mRNS 5'-végével, az RNáz H-val együtt alkalmazzuk, hogy katalizálja az 5'-végi oligonukleotid célzott hasítását, amely sapkát tartalmaz.
3. lépés: IP-RP-HPLC/LC-MS
Az oligonukleotid LC-MS analízisben az előnyben részesített kromatográfiás mód az ionpáros, fordított fázisú (IP-RP) elválasztás, amin mozgófázisú adalékok felhasználásával. Ez a kiváló felbontóképességüknek és a tömegspektrometriával (MS) való kompatibilitásuknak tulajdonítható.
4. lépés. Adatelemzés
Az m7GpppG sapkát tartalmazó hasítási fragmensekben megfigyelhető megkülönböztető tömegek, szemben a difoszfáttal, trifoszfáttal vagy metilálatlan G-sapkával (GpppG), megkönnyítik azonosításukat és lehetővé teszik a kupakolás hatékonyságának becslését.
LC-MS-sel végzett korlátok hatékonyságának elemzése
A Yaohai-Bio Pharma robusztus módszereket fejlesztett ki az mRNS-korlátozás hatékonyságának elemzésére, az oligonukleotid sín (próba) tervezésétől, az RNáz H hasításon, az IP-RP-HPLC/LC-MS-en át az adatelemzésig.
Az 5'-végi hasítási fragmentumok teljes ionkromatogramja (balra) és elektrospray tömegspektruma (jobbra)
EN
