mRNA polyA Χαρακτηρισμός

mRNA 3' πολυ(Α) Χαρακτηρισμός

Η 3' πολυ(Α) ουρά (πολυαδενοσίνες) του mRNA είναι αναπόσπαστο κομμάτι της μετα-μεταγραφικής ρύθμισης, επηρεάζοντας την εξαγωγή, τη σταθερότητα και τη μετάφραση του mRNA. Στην περίπτωση των in vitro-μεταγραφόμενων (IVT) mRNAs, η ουρά πολυ(Α) εισάγεται είτε κατά τη διάρκεια της συν-μεταγραφής με τρόπο μήτρας είτε μέσω μιας ενζυμικής διαδικασίας ουράς με τρόπο μη εκμαγείο. Αυτό το 3' πολυ(Α) χρησιμεύει ως κρίσιμο χαρακτηριστικό ποιότητας (CQA) για τα IVT RNA, που απαιτεί λεπτομερή χαρακτηρισμό τόσο κατά την ανάπτυξη της διαδικασίας όσο και κατά την απελευθέρωση παρτίδας.

Η Yaohai Bio-Pharma παρέχει εξειδικευμένες υπηρεσίες χαρακτηρισμού πολυ(Α) 3', χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως διάσπαση ριβονουκλεάσης T1 (RNase T1), υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης ζευγών ιόντων (IP-RP-HPLC)/υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (LC-MS), και ολοκληρωμένη ανάλυση δεδομένων.

Ρυθμιστικές απαιτήσεις για χαρακτηρισμό mRNA 3' πολυ(Α).

Σύμφωνα με τις κανονιστικές εκτιμήσεις του ΠΟΥ, «η ακεραιότητα της δομής του mRNA θεωρείται κρίσιμο χαρακτηριστικό ποιότητας για την απελευθέρωση του mRNA. Επομένως, απαιτείται έλεγχος για την ακεραιότητα του mRNA, την αποτελεσματικότητα κάλυψης 5', την παρουσία ή το μήκος ουράς 3' πολυ(Α) και ούτω καθεξής."

Αναλυτική Μέθοδος

Διαδικασία

Βήμα 1. Διάσπαση RNase T1

Η άμεση ανάλυση ακέραιου mRNA πλήρους μήκους με LC-MS δεν είναι πρακτική λόγω του μεγέθους και της ετερογένειάς του. Για να εξεταστεί η ουρά πολυ(Α), πρέπει να αποκοπεί από το πλήρους μήκους mRNA. Η επικρατούσα μέθοδος περιλαμβάνει ενζυματική πέψη με RNase T1, διασπώντας επιλεκτικά το 3' άκρο του rG ενώ διατηρείται η πολυ(Α) αλληλουχία. Το δείγμα mRNA υφίσταται πέψη με RNase T1 και θραύσματα διάσπασης που περιέχουν εκτάσεις πολυ(Α) απομονώνονται χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια επικαλυμμένα με ολίγο dT.

Βήμα 2. IP-RP-HPLC/LC-MS

Οι εξαγόμενες ουρές υποβλήθηκαν σε ανάλυση χρησιμοποιώντας LC-MS, προσφέροντας ακριβείς πληροφορίες για το μήκος της ουράς σε ανάλυση ενός νουκλεοτιδίου. Στην ολιγονουκλεοτιδική ανάλυση LC-MS, οι διαχωρισμοί ανάστροφης φάσης ζευγαρώματος ιόντων (IP-RP) με πρόσθετα κινητής φάσης αμίνης αποτελούν τον προτιμώμενο χρωματογραφικό τρόπο, λόγω της ισχυρής ικανότητας διαχωρισμού και της συμβατότητάς τους με τη φασματομετρία μάζας (MS).

Βήμα 3. Ανάλυση δεδομένων

Το μήκος της ουράς πολυ(Α) και η σχετική αφθονία του εξαρτώνται από τον αριθμό και την ένταση των κορυφών που διαιρούνται με μια μάζα αδενοσίνης. Κατά την επεξεργασία ή την αποσυνέλιξη του φάσματος μάζας, διακρίνεται η αναμενόμενη μάζα μιας ουράς πολυ(Α) 100-μερών (33,163 Da στο κουτί), συνοδευόμενη από μια σειρά μαζών που απέχουν κατά 329 amu, ισοδύναμη με τη μάζα της αδενοσίνης (Α). .

Περίπτωση 3' πολυ(Α) χαρακτηρισμού με LC–MS

Η Yaohai-BioPharma έχει αναπτύξει μια ισχυρή μέθοδο για τον χαρακτηρισμό mRNA 3' πολυ(Α), συμπεριλαμβανομένης της διάσπασης RNase T1 και IP-RP-HPLC/LC-MS.

Η Yaohai-BioPharma έχει αναπτύξει μια ισχυρή μέθοδο για τον χαρακτηρισμό mRNA 3' πολυ(Α), συμπεριλαμβανομένης της διάσπασης RNase T1 και IP-RP-HPLC/LC-MS.