Όσον αφορά την κατά παρτίδα παρασκευή προδρόμων RNA, μια συνήθως χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η in vitro μεταγραφή (IVT). Η αντίδραση IVT χρησιμοποιεί γραμμικοποιημένο πλασμιδιακό DNA που περιέχει τον προαγωγέα Τ7 ως εκμαγείο και συνθέτει έναν πρόδρομο RNA με τριφωσφορικούς νουκλεοζίτες (NTPs) ως υπόστρωμα παρουσία πολυμεράσης Τ7 RNA.
Οι μέθοδοι κυκλοποίησης in vitro περιλαμβάνουν τη χημική απολίνωση, την ενζυματική απολίνωση και τη μέθοδο μετατεθέντος ιντρονίου-εξονίου (ΡΙΕ). Η χημική σύνδεση και η ενζυματική απολίνωση είναι κατάλληλες για την κυκλοποίηση βραχύτερων RNA. Όταν το θραύσμα είναι μεγαλύτερο από 100 nt, ο ρυθμός κυκλοποίησης θα μειωθεί πολύ. Αντίθετα, η μέθοδος νουκλεάσης που βασίζεται στο σύστημα PIE μπορεί να επιτύχει κυκλοποίηση αλληλουχιών 8 kb.
Κάτω από την κατάλυση της τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP), η δομή PIE υφίσταται κυκλοποίηση αλληλουχιών εξω-ιντρονίων. Σε συνδυασμό με μια λογική στρατηγική για την αύξηση του ρυθμού κυκλοποίησης, η Yaohai Bio-Pharma μπορεί να επιτύχει κυκλοποίηση αλληλουχιών έως και 4 kb, με απόδοση κυκλοποίησης μεγαλύτερη από 80%.
Η in vitro αντίδραση κυκλοποίησης του RNA ρέει ως εξής:
Ο πρόδρομος RNA συντίθεται με in vitro μεταγραφή και το συστατικό PIE ολοκληρώνει το αυτο-μάτισμα υπό την κατάλυση του GTP για να σχηματίσει circRNA.
Στοιχεία υπηρεσιών
| Διαδικασία |
Λεπτομέρειες υπηρεσιών |
Περίοδος παράδοσης (Εργάσιμη ημέρα) |
| Μεταγραφή και κυκλοφορία in vitro |
Επιβεβαίωση συστήματος αντίδρασης |
1-2 |
| Αντιδράσεις in vitro μεταγραφής και κυκλοποίησης |
| Πέψη RNase R |
| Βελτιστοποίηση αντίδρασης |
Σύνθεση αντίδρασης, βελτιστοποίηση χρόνου |
2-5 |
Τα χαρακτηριστικά μας
- Αυστηρός σχεδιασμός δοκιμών και βελτιστοποίηση
Μπορεί να επιτευχθεί έως και 4 kb κυκλοποίησης RNA.
- Υψηλή απόδοση κυκλοποίησης
Ένα ποσοστό κυκλοποίησης άνω του 80% μπορεί να επιτευχθεί μέσω μιας ορθολογικής στρατηγικής βελτιστοποίησης ακολουθίας.
- Αυστηρός έλεγχος της RNase
Μέσω του αυστηρού ελέγχου των RNases στο πειραματικό περιβάλλον και τα αναλώσιμα, αποτρέπεται αποτελεσματικά η αποικοδόμηση του RNA.
Μελέτη περίπτωσης
In vitro κυκλοποίηση και εμπλουτισμός του circRNA
Με βάση το σύστημα PIE, η Yaohai Bio-Pharma έχει βελτιστοποιήσει την αλληλουχία του circRNA, με ποσοστό κυκλοποίησης άνω του 80% με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης (AGE). Χρησιμοποιώντας RNase R για τον εμπλουτισμό του circRNA, τα αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης E-gel δείχνουν ότι ο γραμμικός πρόδρομος RNA υποβάλλεται σε πέψη και μετά από περαιτέρω καθαρισμό, το μεγαλύτερο μέρος του χαραγμένου circRNA μπορεί να αφαιρεθεί. Το διάλυμα καθαρισμού αναπτύχθηκε από την Yaohai Bio-Pharma.
Κυκλοφορία in vitro και εμπλουτισμός του circRNA
EL
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
IT
JA
KO
ΟΧΙ
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
