Η Yaohai Bio-Pharma παρασκευάζει circRNA με βάση το σύστημα PIE (ευθυγράμμιση εξονίων και ιντρονίων), το οποίο βασίζεται στη λειτουργία αυτοματισμού των ιντρονίων τύπου Ι για την επίτευξη κυκλοποίησης RNA. Η δομή PIE έχει σχεδιαστεί χρησιμοποιώντας το γονίδιο T4 td ή το γονίδιο πρόδρομο tRNA fishy και η διάταξη έχει ως εξής:
Το εσώνιο RNA και το υποστηρικτικό τμήμα του εξονίου χωρίζονται σε δύο μέρη (5' τερματικό και 3' τερματικό), όπου η 5' τερματική αλληλουχία μεταφέρεται στην ουρά της αλληλουχίας στόχου, η 3' τερματική αλληλουχία εισάγεται στο μπροστινό μέρος της αλληλουχία στόχου και η αλληλουχία γονιδίου στόχου εισάγεται στη μέση.
Κάτω από την κατάλυση του GTP, η δομή PIE οδηγεί στην κυκλοποίηση αλληλουχιών διαφορετικών από τα ιντρόνια. Σε συνδυασμό με μια λογική στρατηγική ενίσχυσης του ρυθμού κυκλοποίησης, η Yaohai Bio-Pharma μπορεί να επιτύχει κυκλοποίηση αλληλουχιών έως 4 kb με ρυθμό κυκλοποίησης άνω του 80%.
Εικόνα 1. In vitro κυκλοφορία του circRNA με βάση το σύστημα PIE
Διαδικασία | Προαιρετική εξυπηρέτηση | Λεπτομέρειες υπηρεσιών | Περίοδος παράδοσης (εργάσιμη ημέρα) |
Σχεδιασμός και βελτιστοποίηση ακολουθιών circRNA | Σχεδιασμός και βελτιστοποίηση ακολουθιών κωδικοποίησης |
Ευθυγράμμιση ακολουθίας CDS Βελτιστοποίηση κωδικονίων CDS |
1 |
Σχεδιασμός και βελτιστοποίηση μη κωδικοποιητικών ακολουθιών |
Σχεδιασμός και βελτιστοποίηση ακολουθιών ιντρονίων και εξονίων Σχεδιασμός και βελτιστοποίηση ομόλογης ακολουθίας βραχίονα Σχεδιασμός και βελτιστοποίηση ακολουθίας διαστήματος |
1-2 |
Συστατικά CircRNA | Βιολογικές Λειτουργίες | Στρατηγικές Βελτιστοποίησης | |
Αλληλουχίες εσωνίων και εξονίων με δύο τερματικά | Αυτο-μάτισμα ιντρονίου καταλυόμενο από GTP για κυκλοποίηση αλληλουχιών εκτός του εσωνίου. | Σχεδιασμένο σύμφωνα με το γονίδιο T4 td ή το πρόδρομο γονίδιο tRNA ιχθυελαίου. | |
Κωδικοποίηση | IRES | Εσωτερική θέση αναγνώρισης ριβοσώματος που ρυθμίζει τη μετάφραση του circRNA. | Διαλογή αλληλουχιών εσωτερικής θέσης εισόδου ριβοσώματος (IRES) από διαφορετικές πηγές ιών, π.χ. πηγές EMCV, CVB3. |
CDS | Περιοχές κωδικοποίησης πρωτεΐνης, αλληλουχίες που κωδικοποιούν αντιγόνα, αντισώματα ή άλλες λειτουργικές πρωτεΐνες. | Η βελτιστοποίηση κωδικονίων αυξάνει το επίπεδο μετάφρασης. ορισμένα μη βέλτιστα κωδικόνια μπορεί να παίζουν ρόλο στην αναδίπλωση των πρωτεϊνών. | |
Μη κωδικοποίηση | Μη κωδικοποιητικές ακολουθίες | Στοχεύστε miRNAs ή πρωτεΐνες για να ασκήσετε ρύθμιση γονιδίων ή πρωτεϊνών. | Η στόχευση συγκεκριμένων θέσεων δέσμευσης για miRNAs ή πρωτεΐνες μπορεί να επαναλάβει τις αλληλουχίες της θέσης δέσμευσης. |
Η Yaohai Bio-Pharma κυκλοφόρησε το προϊόν ελέγχου ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (eGFP) circRNA, το οποίο βασίζεται στο σύστημα PIE για την επίτευξη της κυκλοποίησης του RNA.
Χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό αντιδραστήριο μορφομετατροπής, το eGFP circRNA διαμολύνεται σε κύτταρα 293T και το φθορίζον σήμα eGFP (πράσινο) μπορεί να ανιχνευθεί μετά από 24 ώρες, το οποίο θα ενισχυθεί μετά από 48 ώρες. Το φθορίζον σήμα μπορεί ακόμα να ανιχνευθεί την 7η ημέρα και την 14η ημέρα μετά επιμόλυνση.
In vitro επικύρωση έκφρασης του eGFP circRNA