Αποδοτικότητα κάλυψης mRNA 5
Η Σημασία της Ανάλυσης Αποτελεσματικής Επικάλυψης mRNA 5'
Η δομή του καλύμματος που βρίσκεται στο 5' άκρο του mRNA παίζει καθοριστικό ρόλο στην αποτελεσματική μετάφραση, σταθεροποίηση και μεταφορά των mRNAs εντός των ευκαρυωτών. Στο πλαίσιο του in vitro-μεταγραφόμενου (IVT) mRNA, το κάλυμμα 5' εισάγεται είτε μέσω διαδικασιών συν-μεταγραφικής κάλυψης είτε μέσω ενζυματικής κάλυψης. Ως απαραίτητο συστατικό των IVT RNAs, το κάλυμμα 5′ αποτελεί ένα κρίσιμο χαρακτηριστικό ποιότητας (CQA) που απαιτεί ολοκληρωμένο χαρακτηρισμό κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης της διαδικασίας και της απελευθέρωσης παρτίδας.
Η Yaohai-Bio Pharma παρέχει ολοκληρωμένες λύσεις ανάλυσης απόδοσης κάλυψης 5', που περιλαμβάνουν σχεδιασμό ολιγονουκλεοτιδικών νάρθηκες (ανιχνευτής), διάσπαση RNase H, υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης ζεύγους ιόντων IP-RP- (IP-RP-HPLC)/υγρή χρωματογραφία -φασματομετρία μάζας (LC-MS), ανάλυση δεδομένων.
Ρυθμιστικές απαιτήσεις για την ακεραιότητα του mRNA
Σύμφωνα με τις κανονιστικές εκτιμήσεις του ΠΟΥ, «η ακεραιότητα της δομής του mRNA θεωρείται κρίσιμο χαρακτηριστικό ποιότητας για την απελευθέρωση του mRNA. Επομένως, απαιτείται έλεγχος για την ακεραιότητα του mRNA, την αποτελεσματικότητα κάλυψης 5', την παρουσία ή το μήκος ουράς 3' πολυ(Α) και ούτω καθεξής."
Αναλυτική Μέθοδος
Ανάλυση |
Μέθοδοι |
Αποδοτικότητα κάλυψης mRNA 5 |
LC-MS μετά την πέψη |
Διαδικασία
Βήμα 1. Σχεδιασμός ολιγονουκλεοτιδικών νάρθηκων (ανιχνευτής).
Ο ανιχνευτής διάσπασης, που ενσωματώνει 2'-Ο-μεθυλονουκλεοτίδια και τετραδεοξυριβονουκλεοτίδια, χρησιμεύει για τη διάσπαση ενός συμπληρωματικού κλώνου RNA σε συγκεκριμένες θέσεις όταν υπάρχει RNase Η. Αυτή η μέθοδος αποδεικνύεται εξαιρετικά πολύτιμη για τη στοχευμένη παραγωγή μεγαλύτερων θραυσμάτων RNA.
Βήμα 2. Διάσπαση RNase H
Ένας βιοτινυλιωμένος ανιχνευτής, στρατηγικά σχεδιασμένος για να είναι συμπληρωματικός στο 5' άκρο του mRNA, εφαρμόζεται σε συνδυασμό με RNase Η για να καταλύσει τη στοχευμένη διάσπαση του ολιγονουκλεοτιδίου 5' άκρου που διαθέτει δομή καπακιού.
Βήμα 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Στην ολιγονουκλεοτιδική ανάλυση LC-MS, ο προτιμώμενος χρωματογραφικός τρόπος είναι οι διαχωρισμοί ανάστροφης φάσης ζευγαρώματος ιόντων (IP-RP) που χρησιμοποιούν πρόσθετα κινητής φάσης αμίνης. Αυτό αποδίδεται στην ανώτερη διακριτική τους ισχύ και τη συμβατότητά τους με τη φασματομετρία μάζας (MS).
Βήμα 4. Ανάλυση δεδομένων
Διακεκριμένες μάζες που παρατηρούνται σε θραύσματα διάσπασης που διαθέτουν κάλυμμα m7GpppG, σε αντίθεση με εκείνες με διφωσφορικό, τριφωσφορικό ή μη μεθυλιωμένο G κάλυμμα (GpppG), διευκολύνουν την αναγνώρισή τους και επιτρέπουν την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας κάλυψης.
Περίπτωση ανάλυσης απόδοσης κάλυψης με LC–MS
Η Yaohai-Bio Pharma έχει αναπτύξει ισχυρές μεθόδους για ανάλυση αποτελεσματικότητας κάλυψης mRNA, από το σχεδιασμό ολιγονουκλεοτιδικών νάρθηκων (ανιχνευτή), διάσπαση RNase H, IP-RP-HPLC/LC-MS έως ανάλυση δεδομένων.
Τα χρωματογραφήματα ολικών ιόντων (αριστερά) και τα φάσματα μάζας ηλεκτροψεκασμού (δεξιά) των τεμαχίων διάσπασης 5' άκρου
EN
