Các kỹ thuật lắp ráp đổi mới cho tổng hợp gen quy mô lớn

Công nghệ lắp ráp để tổng hợp các mảnh DNA lớn từ đầu là nền tảng của việc tổng hợp gen, bao gồm các phương pháp như BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, lắp ráp Gibson, CPEC và Overlap PCR. Do hạn chế của công nghệ hiện nay trong việc tổng hợp chính xác DNA có độ dài của gen trong một bước duy nhất, cần kết hợp các kỹ thuật lắp ráp in vitro và in vivo để lắp ráp các mảnh oligonucleotide được tổng hợp theo đoạn thành các mảnh DNA dài.

Kỹ thuật lắp ráp in vitro

Chúng được phân loại thành nhiều phương pháp khác nhau dựa trên kích thước mảnh và đặc điểm chuỗi, với yêu cầu chung là phải sử dụng enzym công cụ. PCR chồng chéo, dựa trên phương pháp DNA polymerase, có thao tác đơn giản và nhanh chóng. Các phương pháp BioBrick và BglBrick, dựa vào isoschizomer, cho phép lắp ráp chuẩn hóa, mặc dù phương pháp BioBrick không phù hợp cho protein fusion. Phương pháp nhân bản Golden Gate, dựa trên enzym hạn chế loại IIS, cho phép nối liền hiệu quả nhiều mảnh mà không để lại dấu vết. Phương pháp lắp ráp Gibson, sử dụng kết hợp nhiều enzym công cụ, cho phép nối liền không để lại dấu vết với kích thước mảnh đạt vài trăm kb. Thiết kế chuẩn hóa của các thành phần DNA tăng cường tỷ lệ sử dụng của các mảnh sẵn có.

Kỹ thuật lắp ráp in vivo

Mặc dù trong thể nghiệm kích thước mảnh lắp ráp có thể đạt vài trăm kb, nhưng sản lượng thường không đủ, đòi hỏi phải phóng đại bằng cách sử dụng sinh vật như Escherichia coli. Trong việc ghép các mảnh vượt quá 20 kb, thường sử dụng các hệ thống tái tổ hợp bên trong sinh vật, bao gồm Bacillus subtilis, nấm men và vi khuẩn được biến đổi gen. Nấm men, với vai trò là một chủ thể thường dùng, đã được công nhận vì khả năng tái tổ hợp đồng nguồn hiệu quả trong nhiều năm. Nó có thể được sử dụng để lắp ráp các nhiễm sắc thể nhân tạo dài tới vài megabase (Mb). Ngoài ra, Saccharomyces cerevisiae cho thấy khả năng chịu đựng phi thường về độ dài nhiễm sắc thể, cung cấp cơ sở lý thuyết cho việc sử dụng nấm men để xây dựng các nhiễm sắc thể siêu dài ở sinh vật bậc cao.

Ứng dụng

Yaohai Bio-Pharma chủ yếu sử dụng hai phương pháp lắp ráp cho tổng hợp gen: lắp ráp bằng enzym ligase và lắp ráp bằng enzym DNA polymerase. Phương pháp lắp ráp bằng enzym ligase kết nối các mảnh oligonucleotide 5'-phosphorylated chồng lên và lai hóa thành DNA hai sợi bằng enzym DNA ligase. Phương pháp lắp ráp bằng enzym polymerase sử dụng DNA polymerase để mở rộng các mảnh oligonucleotide chồng lên thông qua quá trình lai hóa, thu được một hỗn hợp có nhiều độ dài khác nhau, và cuối cùng khuếch đại các mảnh đã lắp ráp đầy đủ bằng cách sử dụng các primer. Yaohai có thể giúp khách hàng đáp ứng các yêu cầu cụ thể trong tổng hợp gen.

Chúng tôi cũng đang tích cực tìm kiếm đối tác toàn cầu là tổ chức hoặc cá nhân. Chúng tôi cung cấp mức bồi thường cạnh tranh nhất trong ngành. Nếu bạn có bất kỳ câu hỏi nào, xin vui lòng liên hệ với chúng tôi: [email protected]