Khai thác sức mạnh của chiến lược lên men Fed-batch

Pichia pastoris được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nhiều loại protein dị loại. Công nghệ lên men mật độ tế bào cao (HCDF), được triển khai thông qua phương pháp cho ăn Fed-Batch, đã đạt được thành công trong sản xuất dược phẩm sinh học và enzyme công nghiệp quy mô lớn. Trong môi trường được kiểm soát chính xác, việc sử dụng công nghệ HCDF có thể thu được protein tái tổ hợp có năng suất cao, hoạt tính cao và hiệu quả về chi phí.

Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng thông qua các chiến lược HCDF, những nỗ lực đang được thực hiện để tăng sản lượng và hoạt động của các protein dị loại trong Pichia pastoris. Công nghệ HCDF cho phép dễ dàng đạt được các cụm tế bào cấp cao trong môi trường xác định, do đó cho phép thu được các protein tái tổ hợp dồi dào với hoạt động được tăng cường và giảm chi phí thông qua HCDF. Tuy nhiên, việc lựa chọn chiến lược HCDF phù hợp để tối ưu hóa biểu hiện cấp cao của các protein cụ thể trong Pichia pastoris vẫn là một thách thức.

Lên men mật độ tế bào cao (HCDF)

Pichia pastoris nổi trội trong sản xuất protein dị loại, được ưa chuộng cho HCDF trong các lò phản ứng sinh học tự động. HCDF có 3 giai đoạn: mẻ glycerol, cho ăn và cảm ứng methanol. Yaohai Bio-Pharma tự hào có hơn một thập kỷ kinh nghiệm trong quá trình lên men vi sinh và đã phục vụ hơn 400 dự án. Công ty sở hữu chuyên môn sâu rộng và công nghệ phát triển tốt, cho phép sử dụng nhiều chiến lược HCDF khác nhau để cải thiện hiệu quả sản xuất protein.

Methanol đóng vai trò vừa là chất gây cảm ứng AOX1 vừa là nguồn cacbon, nhưng nồng độ của nó phải được kiểm soát để ngăn ngừa độc tính. Đánh giá các chiến lược cho ăn methanol khác nhau là rất quan trọng để tối ưu hóa sự phát triển của Pichia pastoris và biểu hiện protein

Chiến lược cảm ứng metanol

Trong chiến lược cảm ứng methanol HCDF fed-batch, các chiến lược cảm ứng dựa trên trạng thái bao gồm một tập hợp các phương pháp kiểm soát điều chỉnh việc bổ sung methanol thông qua kiểm soát trực tuyến/ngoại tuyến hoặc tiến/lùi. Trong số các chiến lược cảm ứng thống kê, các chiến lược chính bao gồm μ-stat, Oxy hòa tan (DO)-stat, methanol-stat và biomass-stat.

1.1 μ-thống kê

Chiến lược μ-stat giữ cho sinh khối ổn định bằng cách kiểm soát μ, hỗ trợ khả năng tái tạo và nghiên cứu tác động của μ lên biểu hiện protein. Tuy nhiên, nó thiếu sự kiểm soát trực tiếp methanol và DO, gây nguy cơ tích tụ và tạo ra ROS.

1.2 DO-thống kê

Chiến lược DO-stat gián tiếp điều chỉnh nguồn cấp methanol bằng cách kiểm soát oxy hòa tan để duy trì quá trình oxy hóa, nhưng không cố định nồng độ methanol và tốc độ tăng trưởng, điều này có thể ảnh hưởng đến việc nghiên cứu biểu hiện protein. Oxy hóa đặt ra thách thức trong quá trình lên men hiếu khí và trong khi việc bổ sung oxy nguyên chất có thể tốn kém và độc hại, thì tăng áp suất là một phương pháp kinh tế hơn, đồng thời cũng có thể tăng cường hoạt động của protein.

1.3 Metanol-stat

Việc kiểm soát không đầy đủ nồng độ methanol gây ra những hạn chế cho cả chiến lược μ-stat và DO-stat. Các chiến lược thống kê methanol, hoạt động ở chế độ bật/tắt, dễ bị dao động và thiếu độ chính xác. Ngược lại, bộ điều khiển PID cung cấp khả năng điều chỉnh nồng độ methanol chính xác hơn, nâng cao hiệu quả lên men tổng thể.

1.4 Thống kê sinh khối

Chiến lược biomass-stat xác định mối quan hệ giữa sinh khối và quá trình cho ăn methanol, tối ưu hóa tỷ lệ cho ăn methanol để tăng sản lượng protein. Giám sát sinh khối trực tuyến thực tế hơn, với phương pháp được ưu tiên là đo lưu lượng tế bào. Ở quy mô 1000L, việc tối ưu hóa tỷ lệ cho ăn methanol cải thiện đáng kể hoạt động của enzyme, sản lượng và năng suất, vượt trội hơn quá trình lên men trong bình.

Chiến lược đồng nuôi

Glycerol, với tư cách là chất ức chế chất xúc tiến AOX1, phải được tiêu thụ hoàn toàn trước khi cảm ứng methanol để tránh ức chế sản xuất protein. Các chất nền đồng hành có thể tăng cường hoạt động của enzyme nhưng glycerol dư thừa có thể gây hại cho sự phát triển và biểu hiện. Sorbitol, axit ascorbic, mannitol và các chất khác có thể thay thế glycerol, làm giảm thời gian phân giải protein và nuôi cấy, đồng thời tăng cường biểu hiện protein.

Ngân hàng chủng đòi hỏi phải áp dụng các phương pháp bảo quản thích hợp và đặt trong môi trường phù hợp để duy trì tính ổn định của các đặc tính chủng. Yaohai Bio-Pharma có thể đáp ứng các yêu cầu về bảo quản kho glycerol (thông qua tủ đông nhiệt độ cực thấp hoặc nitơ lỏng) và bảo quản đông khô nấm men và E. coli.

Chiến lược hạn chế gây ra

Ở Pichia pastoris, các điều kiện hạn chế như DO thấp, nồng độ methanol và giới hạn oxy thúc đẩy biểu hiện protein tái tổ hợp. Các điều kiện hạn chế oxy kích hoạt chất xúc tiến AOX1 thông qua sự tích tụ methanol, tăng sản lượng protein trong khi giảm nhiệt. Cảm ứng nhiệt độ thấp làm tăng năng suất, hoạt động, độ ổn định và khả năng sống của tế bào nhưng làm tăng chi phí làm mát. Giới hạn pH và nitơ cũng hỗ trợ biểu hiện, đòi hỏi phải thận trọng để tránh các vấn đề về vận hành. Giới hạn nitơ làm tăng đáng kể năng suất protein cụ thể.

Yaohai Bio-Pharma cũng đang tích cực tìm kiếm các đối tác toàn cầu là tổ chức hoặc cá nhân và cung cấp mức lương cạnh tranh nhất trong ngành. Nếu bạn có bất kỳ câu hỏi nào, vui lòng liên hệ với chúng tôi: [email protected]