Tận Dụng Sức Mạnh Của Chiến Lược Fermentation Batches Liên Tục

Pichia pastoris được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các protein dị nguyên khác nhau. Công nghệ lên men mật độ tế bào cao (HCDF), được thực hiện thông qua việc bổ sung theo phương pháp Fed-Batch, đã thành công trong việc sản xuất quy mô lớn các sinh dược phẩm và enzym công nghiệp. Trong môi trường được kiểm soát chính xác, việc sử dụng công nghệ HCDF có thể đạt được protein tái tổ hợp với năng suất cao, hoạt tính cao và chi phí hiệu quả.

Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng thông qua các chiến lược HCDF, người ta đang nỗ lực để tăng cường sản lượng và hoạt tính của protein dị nguyên trong Pichia pastoris. Công nghệ HCDF cho phép dễ dàng đạt được các cụm tế bào ở mức cao trong môi trường được định nghĩa, từ đó có thể thu được số lượng lớn protein tái tổ hợp với hoạt tính được cải thiện và chi phí giảm thông qua HCDF. Tuy nhiên, việc chọn chiến lược HCDF phù hợp để tối ưu hóa biểu hiện ở mức cao của protein cụ thể trong Pichia pastoris vẫn là một thách thức.

High-Cell-Density Fermentation (HCDF)

Pichia pastoris xuất sắc trong việc sản xuất protein heterologous, được ưa chuộng cho HCDF trong các bioreactor tự động. HCDF có 3 giai đoạn: glycerol batch, cung cấp chất dinh dưỡng và cảm ứng methanol. Yaohai Bio-Pharma tự hào có hơn một thập kỷ kinh nghiệm trong lên men vi sinh và đã phục vụ hơn 400 dự án. Công ty có chuyên môn sâu rộng và công nghệ phát triển tốt, cho phép sử dụng nhiều chiến lược HCDF khác nhau để cải thiện hiệu suất sản xuất protein.

Methanol vừa là chất cảm ứng của AOX1 vừa là nguồn carbon, nhưng nồng độ của nó phải được kiểm soát để tránh độc tính. Việc đánh giá các chiến lược cung cấp methanol khác nhau là rất quan trọng để tối ưu hóa sự tăng trưởng của Pichia pastoris và biểu hiện protein.

Chiến lược cảm ứng methanol

Trong chiến lược cảm ứng methanol HCDF theo lô, các chiến lược cảm ứng dựa trên trạng thái bao gồm một tập hợp các phương pháp điều khiển điều chỉnh việc bổ sung methanol thông qua điều khiển trực tuyến/gián tiếp hoặc điều khiển tiến/lùi. Trong số các chiến lược cảm ứng thống kê, những chiến lược chính bao gồm μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat và biomass-stat.

1.1 μ-stat

chiến lược μ-stat giữ cho khối lượng sinh khối ổn định bằng cách kiểm soát μ, giúp tăng tính tái hiện và nghiên cứu tác động của μ đối với biểu hiện protein. Tuy nhiên, nó thiếu kiểm soát trực tiếp methanol và DO, dẫn đến nguy cơ tích tụ và tạo ra ROS.

1.2 DO-stat

Chiến lược DO-stat gián tiếp điều chỉnh lượng methanol cung cấp bằng cách kiểm soát oxy hòa tan để duy trì quá trình oxy hóa, nhưng nó không cố định nồng độ methanol và tốc độ tăng trưởng, điều này có thể ảnh hưởng đến việc nghiên cứu biểu hiện protein. Việc duy trì oxy hóa là một thách thức trong lên men hiếu khí, và mặc dù bổ sung oxy tinh khiết có thể đắt đỏ và độc hại, việc tăng áp suất là phương pháp kinh tế hơn và cũng có thể cải thiện hoạt tính của protein.

1.3 Methanol-stat

Việc kiểm soát không đầy đủ nồng độ methanol gây ra những hạn chế cho cả chiến lược μ-stat và DO-stat. Các chiến lược thống kê methanol, hoạt động ở chế độ bật/tắt, dễ bị dao động và thiếu độ chính xác. Ngược lại, các bộ điều khiển PID cung cấp sự điều chỉnh chính xác hơn về nồng độ methanol, làm tăng hiệu quả tổng thể của quá trình lên men.

1.4 Biomass-stat

Chiến lược biomass-stat định nghĩa mối quan hệ giữa sinh khối và việc cung cấp methanol, tối ưu hóa tốc độ cung cấp methanol để tăng cường năng suất protein. Giám sát sinh khối trực tuyến là thực tế hơn, với phương pháp cytometry dòng được ưa chuộng. Ở quy mô 1000L, việc tối ưu hóa tốc độ cung cấp methanol cải thiện đáng kể hoạt tính enzym, năng suất và hiệu suất sản xuất, vượt trội hơn so với lên men trong lọ thủy tinh.

Chiến lược đồng cấp

Glycerol, dưới vai trò là chất ức chế chất xúc tác AOX1, phải được tiêu thụ hoàn toàn trước khi gây cảm methanol để tránh ức chế sản xuất protein. Các chất nền đồng thời có thể tăng cường hoạt tính enzym nhưng glycerol dư thừa có thể gây hại cho sự phát triển và biểu hiện gen. Sorbitol, acid ascorbic, mannitol và các chất khác có thể thay thế glycerol, giảm proteolysis và thời gian culti, đồng thời tăng cường biểu hiện protein.

Kho chủng cần thiết phải áp dụng các phương pháp bảo quản phù hợp và đặt trong môi trường thích hợp để duy trì sự ổn định của đặc điểm chủng. Yaohai Bio-Pharma có thể đáp ứng yêu cầu bảo quản glycerol (qua tủ đông nhiệt độ cực thấp hoặc nitơ lỏng) và bảo quản sấy lạnh nấm men và E. coli.

Chiến lược gây hạn chế

Trong Pichia pastoris, các điều kiện hạn chế như DO thấp, nồng độ methanol, và giới hạn oxy tăng cường biểu hiện protein tái tổ hợp. Điều kiện thiếu oxy kích hoạt启动 promoter AOX1 thông qua việc tích tụ methanol, tăng sản lượng protein đồng thời giảm nhiệt độ. Dẫn xuất ở nhiệt độ thấp tăng cường năng suất, hoạt tính, sự ổn định và khả năng sống sót của tế bào nhưng làm tăng chi phí làm mát. pH và giới hạn đạm cũng hỗ trợ quá trình biểu hiện, cần thận trọng để tránh các vấn đề vận hành. Giới hạn đạm đặc biệt tăng cường hiệu suất sản xuất protein cụ thể.

Yaohai Bio-Pharma cũng đang tích cực tìm kiếm đối tác toàn cầu là tổ chức hoặc cá nhân và cung cấp mức bồi thường cạnh tranh nhất trong ngành. Nếu bạn có bất kỳ câu hỏi nào, xin vui lòng liên hệ với chúng tôi: [email protected]