Đặc tính mRNA 3' poly(A)
Đặc tính mRNA 3' poly(A)
Đuôi 3' poly(A) (polyadenosine) của mRNA không thể thiếu trong quá trình điều hòa sau phiên mã, ảnh hưởng đến việc xuất, tính ổn định và dịch mã của mRNA. Trong trường hợp các mRNA được phiên mã in vitro (IVT), đuôi poly(A) được đưa vào trong quá trình đồng phiên mã theo cách tạo khuôn mẫu hoặc thông qua quá trình tạo đuôi bằng enzyme theo cách không tạo khuôn mẫu. 3′ poly(A) này đóng vai trò là thuộc tính chất lượng quan trọng (CQA) đối với RNA IVT, đòi hỏi phải xác định đặc tính kỹ lưỡng trong cả quá trình phát triển quy trình và xuất xưởng hàng loạt.
Yaohai Bio-Pharma cung cấp các dịch vụ xác định đặc tính 3' poly(A) chuyên dụng, sử dụng các kỹ thuật như phân tách ribonuclease T1 (RNase T1), sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo cặp ion (IP-RP-HPLC)/sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) và phân tích dữ liệu toàn diện.
Yêu cầu pháp lý đối với đặc tính mRNA 3' poly(A)
Theo những cân nhắc về quy định của WHO, “tính toàn vẹn của cấu trúc của mRNA được coi là thuộc tính chất lượng quan trọng đối với việc giải phóng mRNA. Do đó, cần phải kiểm soát tính toàn vẹn của mRNA, hiệu suất giới hạn 5′, sự hiện diện hoặc chiều dài đuôi 3′ poly(A), v.v..”
Phương pháp phân tích
nghiên cứu |
Phương pháp |
Đặc tính mRNA 3' poly(A) |
LC-MS sau tiêu hóa |
Thủ tục
Bước 1. Phân cắt RNase T1
Phân tích trực tiếp mRNA nguyên vẹn có chiều dài đầy đủ bằng LC-MS là không thực tế do kích thước và tính không đồng nhất của nó. Để kiểm tra đuôi poly(A), nó phải được tách ra khỏi mRNA có chiều dài đầy đủ. Phương pháp phổ biến liên quan đến quá trình tiêu hóa bằng enzym với RNase T1, cắt có chọn lọc đầu 3’ của rG trong khi vẫn giữ được chuỗi poly(A). Mẫu mRNA trải qua quá trình tiêu hóa bằng RNase T1 và các mảnh phân tách chứa các đoạn poly(A) được phân lập bằng cách sử dụng các hạt từ tính được phủ oligo dT.
Bước 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Các đuôi được chiết xuất đã được phân tích bằng LC-MS, cung cấp thông tin về độ dài đuôi chính xác ở độ phân giải đơn nucleotide. Trong phân tích LC-MS oligonucleotide, việc phân tách pha đảo ngược ghép cặp ion (IP-RP) với các chất phụ gia pha động amin được coi là chế độ sắc ký ưu tiên, nhờ khả năng phân giải mạnh mẽ và khả năng tương thích với phép đo phổ khối (MS).
Bước 3. Phân tích dữ liệu
Chiều dài đuôi poly(A) và độ phong phú tương đối của nó phụ thuộc vào số lượng và cường độ của các pic chia cho khối lượng adenosine. Khi xử lý hoặc giải mã phổ khối, khối lượng dự đoán của đuôi poly(A) 100 mer (33,163 Da trong hộp) được phân biệt rõ ràng, kèm theo một loạt khối lượng cách nhau 329 amu, tương đương với khối lượng của adenosine (A) .
Trường hợp đặc tính 3' poly(A) với LC–MS
Yaohai-BioPharma đã phát triển một phương pháp mạnh mẽ để xác định đặc tính của mRNA 3' poly(A), bao gồm phân tách RNase T1 và IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma đã phát triển một phương pháp mạnh mẽ để xác định đặc tính của mRNA 3' poly(A), bao gồm phân tách RNase T1 và IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
