Hiệu suất giới hạn mRNA 5'
Ý nghĩa của việc phân tích hiệu quả đóng nắp mRNA 5'
Cấu trúc nắp nằm ở đầu 5’ của mRNA đóng vai trò then chốt trong quá trình dịch mã, ổn định và vận chuyển hiệu quả các mRNA trong sinh vật nhân chuẩn. Trong bối cảnh mRNA được phiên mã in vitro (IVT), nắp 5' được đưa vào thông qua quá trình gắn nắp đồng phiên mã hoặc quá trình gắn nắp enzyme. Là thành phần không thể thiếu của IVT RNA, nắp 5’ đóng vai trò là thuộc tính chất lượng quan trọng (CQA) đòi hỏi phải xác định đặc tính toàn diện trong suốt quá trình phát triển quy trình và xuất xưởng lô.
Yaohai-Bio Pharma cung cấp các giải pháp phân tích hiệu quả đóng nắp 5' toàn diện, bao gồm thiết kế nẹp oligonucleotide (đầu dò), phân tách RNase H, sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo IP-RP- cặp ion (IP-RP-HPLC)/sắc ký lỏng -khối phổ (LC-MS), phân tích dữ liệu.
Yêu cầu pháp lý về tính toàn vẹn của mRNA
Theo những cân nhắc về quy định của WHO, “tính toàn vẹn của cấu trúc của mRNA được coi là thuộc tính chất lượng quan trọng đối với việc giải phóng mRNA. Do đó, cần phải kiểm soát tính toàn vẹn của mRNA, hiệu suất giới hạn 5′, sự hiện diện hoặc chiều dài đuôi 3′ poly(A), v.v..”
Phương pháp phân tích
nghiên cứu |
Phương pháp |
Hiệu suất giới hạn mRNA 5' |
LC-MS sau tiêu hóa |
Thủ tục
Bước 1. Thiết kế nẹp Oligonucleotide (đầu dò)
Đầu dò phân tách, kết hợp 2'-O-methylnucleotide và tetradeoxyribonucleotide, dùng để phân tách chuỗi RNA bổ sung tại các vị trí cụ thể khi có RNase H. Phương pháp này tỏ ra có giá trị cao trong việc tạo ra các đoạn RNA lớn hơn theo mục tiêu.
Bước 2. Phân cắt RNase H
Đầu dò biotin hóa, được thiết kế chiến lược để bổ sung cho đầu 5' của mRNA, được sử dụng cùng với RNase H để xúc tác cho quá trình phân cắt mục tiêu của oligonucleotide đầu 5' có cấu trúc nắp.
Bước 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Trong phân tích LC-MS oligonucleotide, chế độ sắc ký được ưu tiên là phân tách pha đảo ghép cặp ion (IP-RP) sử dụng các chất phụ gia pha động amin. Điều này là do khả năng phân giải vượt trội và khả năng tương thích với phép đo phổ khối (MS).
Bước 4. Phân tích dữ liệu
Các khối khác biệt được quan sát thấy trong các mảnh phân tách có nắp m7GpppG, trái ngược với các khối có nắp G diphosphate, triphosphate hoặc không được methyl hóa (GpppG), tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định chúng và cho phép ước tính hiệu quả giới hạn.
Trường hợp phân tích hiệu quả giới hạn bằng LC–MS
Yaohai-Bio Pharma đã phát triển các phương pháp mạnh mẽ để phân tích hiệu quả giới hạn mRNA, từ thiết kế thanh nẹp oligonucleotide (đầu dò), phân tách RNase H, IP-RP-HPLC/LC-MS đến phân tích dữ liệu.
Sắc ký đồ ion tổng (trái) và phổ khối phun điện (phải) của các mảnh phân cắt đầu 5'
EN
