Розкриття секретів високоякісного вилучення плазмід

Екстракція плазміди має вирішальне значення для дослідників. Як генні вектори плазміди є життєво важливими для досліджень вакцин і генної терапії, де якість має значення. До ключових факторів якості належать пропорція суперспіралі та вміст ендотоксину. Правила відрізняються: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, з <5% лінійної/відкритої кільцевої ДНК. Клієнти часто віддають перевагу ≥95% supercoiled. Рівні ендотоксину: дослідження (>50 EU/мкг), трансфекція (<50 EU/мкг) і відсутність ендотоксинів (<0.1 EU/мкг).

Суперскручена плазмідна ДНК

Плазміди Escherichia coli включають суперскручену (SC), відкриту кільцеву (OC) і лінійну (L) ДНК. Висока частка SC підвищує ефективність трансфекції та експресію. Наприклад, трансфекція плазміди 85.45% SC в 2.5 рази вища, а експресія HGF плазміди 93.28% SC в 1.8 раза вища, що підтверджує перевагу ДНК SC.

Відкрита кільцева ДНК: коли один ланцюг дволанцюгової ДНК розривається, суперскручена структура стає вільною, утворюючи відкриту кільцеву плазміду з більшим об’ємом, яка найповільніше мігрує під час електрофорезу та розташовується у верхній частині.

Лінійна ДНК: коли обидва ланцюги плазмідної ДНК розриваються, утворюється лінійна структура з відносно меншим об’ємом, яка мігрує швидше, ніж відкрита кільцева ДНК, але повільніше, ніж суперскручена ДНК, розташована на другому місці.

Суперскручена ДНК: дві спіралі переплітаються, скручуючи в суперскручену структуру на основі спіралі ДНК. Він має найменший об'єм і найшвидше мігрує під час електрофорезу, розташований внизу.

Кількісний аналіз суперскрученої пропорції

Лабораторії використовують електрофорез у агарозному гелі (AGE) та аналізатор Gel-Pro Analyzer, щоб оцінити пропорцію суперспіралі за допомогою зображень електрофорезу. На одному зображенні показано 97.539% SC ДНК, а на іншому показано 63.833% SC і 36.167% OC ДНК (лінійної ДНК не видно).

Секрет ендотоксину в плазмідах

Ендотоксин є компонентом зовнішнього шару клітинної стінки грамнегативних бактерій, який виділяється після загибелі бактерій або лізису, містить токсичний ліпополісахарид А. Під час екстракції плазміди ендотоксин потрапляє в розчин для лізису, впливаючи на ефективність трансфекції та запускаючи неспецифічні імунні відповіді, що призводить до до помилкових спрацьовувань в експериментах.

Кількісний та якісний аналіз ендотоксину

Тест Limulus amebocyte lysate (LAL) виявляє ендотоксин шляхом аглютинації з 2-кето-3-дезоксиоктоновою кислотою (KDO) у ліпополісахариді (LPS). Він буває якісним і напівкількісним, що вказує на наявність ендотоксину через коагуляцію або зміну кольору при змішуванні зі зразками.

Yaohai Bio-Pharma пропонує вільні від ендотоксинів суперспіральні плазміди. Аутсорсинг Yaohai підвищує ефективність трансфекції та експресії. Доставлені плазміди мають частку SC ≥95% (в середньому 85%±10%) і рівні ендотоксину ≤0.1, ≤0.01 або ≤0.005 EU/мкг.

Ми також активно шукаємо інституційних або індивідуальних глобальних партнерів. Ми пропонуємо найконкурентнішу компенсацію в галузі. Якщо у вас виникли запитання, зв’яжіться з нами: CRO@yaohaibio.cn