Використання потенціалу стратегії ферментації Fed-batch

Pichia pastoris широко використовується для виробництва різних гетерологічних білків. Технологія ферментації з високою щільністю клітин (HCDF), реалізована за допомогою Fed-Batch додавання харчів, успішно досягла масштабного виробництва біофармацевтичних засобів та промислових ензимів. У точно контролюваному середовищі використання технології HCDF можна отримати високоякісні, активні та економічні рекомбінантні білки.

Недавні дослідження показують, що за допомогою стратегій HCDF робляться спроби підвищити виробництво та активність гетерологічних білків у Pichia pastoris. Технологія HCDF дозволяє легко досягти високих кластерів клітин у визначених середовищах, що дає можливість отримувати велику кількість рекомбінантних білків з покращеною активністю та зниженими витратами через HCDF. Проте, вибір відповідної стратегії HCDF для оптимізації високорівневого вираження конкретних білків у Pichia pastoris залишається викликом.

Ферментація з високою щільністю клітин (HCDF)

Pichia pastoris відмінно проявляється у виробництві гетерологічних білків, її виборють для HCDF у автоматизованих біореакторах. HCDF має 3 етапи: глицеринова партія, кормлення та індукція метанолом. Yaohai Bio-Pharma має понад десятирічний досвід у микробному ферментуванні та взяла участь більше ніж у 400 проектах. Компанія володіє розгорнутим досвідом та добре розробленою технологією, що дозволяє їй використовувати різні стратегії HCDF для покращення ефективності виробництва білків.

Метанол виступає як індуктор AOX1 та джерело вуглецевих, але його концентрацію необхідно контролювати, щоб уникнути токсичності. Оцінка різних стратегій кормлення метанолом є ключовою для оптимізації росту Pichia pastoris та вираження білків.

Стратегія індукції метанолом

У стратегії фед-батч HCDF індукції метанолом, станові індукційні стратегії включають набір методів керування, які регулюють додаткове введення метанолу через онлайн/офлайн або прямий/зворотний контроль. Серед статистичних індукційних стратегій головними є μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat та biomass-stat.

1.1 μ-stat

стратегія μ-stat підтримує біомасу настійчливими шляхом керування μ, що допомагає воспроизводженню результатів та дослідженню впливу μ на виразку протеїну. Проте вона не має безпосереднього контролю метанолу та DO, що може призводити до накопичення та генерації ROS.

1.2 DO-stat

Стратегія DO-stat косвенно регулює підачу метанолу, керуючи розчинним киснем для підтримання оксигенації, але вона не фіксує концентрацію метанолу та швидкість росту, що може впливати на дослідження експресії білок. Оксигенація є викликом у аеробному ферментуванні, і хоча доповнення чистим киснем може бути витратним і токсичним, підвищення тиску є більш економічним підходом, який також може покращити активність білок.

1.3 Methanol-stat

Недостатньо точне керування концентрацією метанолу ставить обмеження для обох стратегій μ-stat та DO-stat. Метанолові статистичні стратегії, які працюють у режимі вкл./викл., підлягають коливанням і не мають точності. Наспротіг, PID-регулятори забезпечують більш точне регулювання концентрації метанолу, покращуючи загальну ефективність ферментування.

1.4 Biomass-stat

Стратегія biomass-stat визначає зв'язок між біомасою та додаванням метанолу, оптимізуючи швидкість подачі метанолу для підвищення видачі білка. Онлайн-моніторинг біомаси є більш практичним, з використанням цитометрії в потоці як перевагої методу. На рівні 1000 літрів, оптимізація швидкості подачі метанолу значно покращує активність ензимів, видачу та продуктивність, перешкоджаючи ферментному виробництву у скляних колбах.

Стратегія спільного додавання

Глицерин, як інгібітор промотора AOX1, повинен бути повністю використаний перед індукцією метанолом, щоб уникнути подавлення виробництва білка. Спільні субстрати можуть підвищувати активність ензимів, але надмір глицерину може шкодити росту та вираженню. Сорбіт, аскорбінова кислота, манніт і інші можуть замінити глицерин, зменшуючи протеоліз та час вирощування, а також підвищуючи вираження білка.

Банк штамів вимагає застосування відповідних методів зберігання та розміщення в придатному середовищі для підтримання стабільності характеристик штаму. Yaohai Bio-Pharma може задовольнити вимоги для зберігання глицеринових культур (за допомогою ультраморозильних камер або рідинного азоту) та лідово-сухого зберігання дріжджів та E. coli.

Стратегія, індукованна обмеженнями

У Pichia pastoris обмежуючі умови, такі як низький DO, концентрація метанолу та обмеження кисню, сприяють вираженню рекомбінантних білків. Умови обмеження кисню актиvuють промотор AOX1 через накопичення метанолу, що збільшує виробництво білка при зменшенні тепла. Індукція при низьких температурах покращує виробництво, активність, стабільність та життєздатність клітин, але збільшує витрати на охолодження. Регулювання pH та обмеження азоту також сприяють вираженню, потрібно лише бути обережними, щоб уникнути операційних проблем. Обмеження азоту значно покращує продуктивність виробництва специфічного білка.

Yaohai Bio-Pharma також активно шукає глобальних партнерів — інституцій або осіб — і пропонує найбільш конкурентоспроможну компенсацію в галузі. Якщо у вас є будь-які питання, будь ласка, не соромтеся звертатися до нас: [email protected]