Príprava IVT mRNA

In vitro transkripcia (IVT) je preferovaný spôsob prípravy mRNA, ktorý je schopný poskytnúť mikrogramy až miligramy mRNA v laboratórnom meradle. Na výskumné účely dodávatelia činidiel vyvinuli všestranné IVT reakčné systémy vhodné pre mRNA strednej dĺžky (1000-4000 nukleotidov).

V tomto článku zhrnieme in vitro transkripciu (IVT) mRNA, vrátane konvenčného IVT reakčného systému používaného v laboratórnom meradle a IVT reakčného systému vhodného pre ultradlhú mRNA (>9000 nukleotidov).

Súpravy umožňujú ko-transkripčné zakrytie s CleanCap AG a znižujú imunogenicitu pomocou m1ψ. DNáza I odstraňuje zvyškovú DNA. Nízky výťažok môže byť spôsobený zlým miešaním, oxidáciou činidla alebo problémami s templátom DNA, ktoré možno zmierniť centrifugáciou, čerstvými činidlami, kontrolami a úpravou množstva templátu/reakčného času.

Yaohai Bio-Pharma poskytuje rôzne prefabrikované IVT RNA produkty (tekutý/lyofilizovaný prášok) a LNP hotové produkty, kódujúce proteíny, ako sú fluorescenčné proteíny (eGFP, mCHERRY), luciferáza, rekombináza Cre a antigén OVA, na splnenie rôznych experimentov alebo projektov. potreby.

IVT systém pre ultra dlhú mRNA

Konvenčné IVT nemusí fungovať pre príliš dlhú mRNA (>9000 nt). Je potrebné hlboké pochopenie a racionálne nastavenie komponentov IVT.

DNA šablóna: Linearizované plazmidy alebo produkty PCR so zodpovedajúcimi promótorovými sekvenciami rozpustené v H2O bez RNázy. Pre optimálne podmienky IVT sa odporúča koncentrácia templátu DNA vyššia ako 40 nM.

DTT: Udržuje aktivitu enzýmu počas transkripcie. Čerstvý DTT by sa mal pridať do reakčného pufra pre optimálnu aktivitu enzýmu.

Inhibítor RNázy: Inhibuje aktivitu RNázy a udržuje stabilitu mRNA.

T7 RNA polymeráza: Katalyzuje transkripciu DNA do RNA, ktorá zodpovedá sekvencii promótora. Aktivita T7 RNA polymerázy je ovplyvnená pH a iónmi horčíka.

Ióny horčíka (Mg2+): Kofaktor pre RNA polymerázu. Príliš nízke koncentrácie znižujú účinnosť transkripcie, zatiaľ čo príliš vysoké koncentrácie vedú k degradácii RNA. Voľný [Mg2+] by sa mal upraviť na základe koncentrácie nukleotidov. Každý nukleotid chelátuje jeden [Mg2+], takže koncentrácia [Mg2+] by mala prekročiť celkovú koncentráciu nukleotidov.

Nukleozidtrifosfáty (NTP): Ako substráty sú NTP základnými jednotkami RNA. Koncentrácie NTP nad 7 mM majú pozitívny vplyv na produkciu mRNA.

Spermidín: Stabilizuje komplexy DNA-enzým a stimuluje transkripčné reakcie; avšak nadmerné koncentrácie majú inhibičné účinky. Odporúčaná koncentrácia spermidínu je medzi 1 a 3 mM.

Anorganická pyrofosfatáza (PPáza): Pridané do IVT reakcií, aby sa zabránilo akumulácii anorganických pyrofosfátových iónov (PPi), aby sa zabránilo ich chelácii s Mg2+ a zabezpečil sa dostatok voľného Mg2+.

Využitím priekopníckej technológie a skúseností s IVT mRNA poskytuje Yaohai Bio-Pharma komplexnú službu IVT RNA, ktorá zahŕňa návrh sekvencie, prípravu IVT RNA (s mods m1ψ), cyklizáciu RNA, purifikáciu, lyofilizáciu, zapuzdrenie LNP a testovanie kvality.

Aktívne tiež hľadáme inštitucionálnych alebo individuálnych globálnych partnerov. Ponúkame najkonkurencieschopnejšiu kompenzáciu v odvetví. Ak máte akékoľvek otázky, neváhajte nás kontaktovať: [email protected]