Príprava mRNA IVT

Transkripcia in vitro (IVT) je preferovaná metóda na prípravu mRNA, ktorá dokáže vylúčiť mikrogramy až miligramy mRNA na laboratórnej úrovni. Pre výskumové účely vývojári reagentov vyvinuli univerzálne systémy IVT reakcií vhodné pre mRNA strednej dĺžky (1000-4000 nukleotidov).

V tomto článku shrneme transkripciu in vitro (IVT) mRNA, vrátane konvenčného systému IVT reakcie používaného na laboratórnej úrovni a systému IVT vhodného pre ultra-dlhú mRNA (>9000 nukleotidov).

Sady umožňujú spoločnú transkripčnú zakončovaciu skupinu CleanCap AG a zníženie imunogennosti pomocou m1ψ. DNase I odstráni zvyšnú DNA. Nízky výnos môže byť spôsobený nevhodným zamiešaním, oxidáciou reagentov alebo problémami s DNA šablónou, čo sa dá zmierňovať centrifugovánim, čerstvými reagentmi, kontrolami a úpravou množstva šablóny/času reakcie.

Yaohai Bio-Pharma ponúka rôzne predvyrobené produkty IVT RNA (kapalina/prášok na zmrznutie) a LNP hotové produkty, ktoré kodujú proteíny ako fluorescenské proteíny (eGFP, mCHERRY), luciferáza, rekombináza Cre a antigen OVA, aby sa splnili rôzne experimentálne alebo projektové požiadavky.

IVT systém pre ultradlhčiu mRNA

Konvenčne IVT nemusí fungovať pre príliš dlhé mRNA (>9000 nt). Potrebné je hlboké porozumenie a racionálne prispôsobenie komponentov IVT.

DNA šablóna: Lineárne plazmidy alebo PCR produkty s príslušnými sékvensami promotorov, rozpustené v RNase voľnej vode. Pre optimálne podmienky IVT sa odporúča koncentrácia DNA šablóny vyššia ako 40 nM.

DTT: Udržiava enzymovú aktivitu počas transkripcie. Do reakčného buffera by mal byť pridaný свježí DTT pre optimálnu enzymovú aktivitu.

Inhibitor RNase: Inhibuje aktivitu RNase a udržiava stabilitu mRNA.

T7 RNA polymeráza: Katalyzuje preklad DNA do RNA, ktorý odpovedá sekvencii promotoru. Aktivita polymerázy T7 RNA je ovplyvnená pH a ionmi magnezia.

Iony magnezia (Mg2+): Kofaktor pre RNA polymerázu. Príliš nízke koncentrácie znížia účinnosť transkripcie, zatiaľ čo príliš vysoké koncentrácie viedu k degradácii RNA. Voľná koncentrácia [Mg2+] by mala byť upravená na základe koncentrácie nukleotidov. Každý nukleotid špecificky väzne jeden [Mg2+], preto by mala byť koncentrácia [Mg2+] vyššia ako celková koncentrácia nukleotidov.

Nukleozidfrífosfáty (NTP): Ako substráty sú NTP základné jednotky RNA. Koncentrácie NTP vyššie ako 7 mM majú pozitívny vplyv na produkciu mRNA.

Spermidín: Stabilizuje DNA-enzymové komplexy a stimuluje transkripčné reakcie; však príliš vysoké koncentrácie majú inhibujúci efekt. Odporúčaná koncentrácia spermidínu je medzi 1 a 3 mM.

Inorganická pyrofosfatáza (PPase): Pridané do reakcií IVT s cieľom zabrániť akumulácii ionov inorgánickej pyrofosfátu (PPi), čo sa vyhýba ich chelácií s Mg2+ a zabezpečuje dostatočne voľný Mg2+.

Využívaním pionierskej technológie a skúseností s IVT mRNA ponúka Yaohai Bio-Pharma kompletný služobný balík IVT RNA, ktorý zahŕňa dizajn sekvencie, prípravu IVT RNA (s modifikáciami m1ψ), cyklikáciu RNA, čistenie, lyofilizáciu, encapsuláciu LNP a kontrolu kvality.

Hľadáme tiež aktívne globálnych partnerov, či už institucionálnych alebo jednotlivcov. Ponúkame najkonkurenceschopnejšie odškodnenie v odvetví. Ak máte akékoľvek otázky, neváhejte nás kontaktovať: [email protected]