Revelando os Segredos da Extração de Plasmídeos de Alta Qualidade

A extração de plasmídeos é crucial para pesquisadores. Como vetores genéticos, os plasmídeos são fundamentais na pesquisa de vacinas e terapia gênica, onde a qualidade importa. Fatores-chave de qualidade incluem a proporção superenrolada e o conteúdo de endotoxina. As regulamentações variam: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, com <5% de DNA linear/circular-aberto. Os clientes geralmente preferem ≥95% superenrolado. Os níveis de endotoxina são: pesquisa (>50 EU/µg), transfecção (<50 EU/µg) e livre de endotoxina (<0.1 EU/µg).

DNA de Plasmídeo Superenrolado

Os plasmídeos de Escherichia coli incluem DNA superenrolado (SC), circular-aberto (OC) e linear (L). Uma alta proporção de SC aumenta a eficiência de transfecção e expressão. Por exemplo, a transfecção de um plasmídeo com 85,45% SC é 2,5x maior, e a expressão de HGF de um plasmídeo com 93,28% SC é 1,8x maior, confirmando a superioridade do DNA SC.

DNA circular aberto: Quando uma das estradas do DNA duplo se rompe, a estrutura superenrolada se solta, formando um plasmídeo circular aberto com um volume maior que migra mais lentamente durante a eletroforese e está posicionado no topo.

DNA linear: Quando ambas as estruturas do DNA plasmidial se rompem, forma-se uma estrutura linear, com um volume relativamente menor que migra mais rapidamente do que o DNA circular aberto, mas mais lentamente do que o DNA superenrolado, posicionado em segundo lugar.

DNA superenrolado: As duas hélices se entrelaçam, torcendo-se em uma estrutura superenrolada baseada na hélice de DNA. Ele tem o menor volume e migra mais rapidamente durante a eletroforese, posicionado na parte inferior.

Análise Quantitativa da Proporção Superenrolada

Laboratórios usam eletroforese em gel de agarose (AGE) e Gel-Pro Analyzer para avaliar a proporção superenrolada por meio de imagens de eletroforese. Uma imagem mostra 97,539% de DNA SC, enquanto outra mostra 63,833% de DNA SC e 36,167% de DNA OC (DNA linear não visível).

O Segredo dos Endotoxinas nos Plasmídeos

A endotoxina é um componente da camada externa da parede celular de bactérias Gram-negativas, liberada após a morte ou lise bacteriana, contendo lipopolissacarídeo tóxico A. Durante a extração de plasmídeos, a endotoxina entra na solução de lise, afetando a eficiência de transfeção e desencadeando respostas imunológicas não específicas, levando a falsos positivos em experimentos.

Análise Quantitativa e Qualitativa de Endotoxina

O teste de lisado de amebócitos de Limulus detecta endotoxina por aglutinação com o 2-ceto-3-deoxioctonato (KDO) no lipopolissacarídeo (LPS). Ele é qualitativo e semi-quantitativo, indicando a presença de endotoxina através de coagulação ou mudança de cor ao ser misturado com amostras.

Yaohai Bio-Pharma oferece plasmídeos superenrolados livres de endotoxina. Subcontratar para Yaohai aumenta a eficiência de transfeção e expressão. Os plasmídeos entregues têm uma proporção ≥95% SC (média 85%±10%) e níveis de endotoxina ≤0,1, ≤0,01 ou ≤0,005 EU/μg.

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