Desvendando os segredos da extração de plasmídeos de alta qualidade

A extração de plasmídeo é crucial para pesquisadores. Como vetores de genes, os plasmídeos são vitais na pesquisa de vacinas e terapia genética, onde a qualidade importa. Os principais fatores de qualidade incluem proporção superenrolada e conteúdo de endotoxina. Os regulamentos variam: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, com <5% de DNA linear/circular aberto. Os clientes geralmente preferem ≥95% superenrolado. Os níveis de endotoxina são: pesquisa (>50 UE/µg), transfecção (<50 UE/µg) e livre de endotoxina (<0.1 UE/µg).

DNA plasmídeo superenrolado

Plasmídeos de Escherichia coli incluem DNA superenrolado (SC), circular aberto (OC) e linear (L). A alta proporção de SC aumenta a eficiência e a expressão da transfecção. Por exemplo, a transfecção de um plasmídeo SC de 85.45% é 2.5x maior, e a expressão de HGF de um plasmídeo SC de 93.28% é 1.8x maior, confirmando a superioridade do DNA SC.

DNA circular aberto: quando uma fita de DNA fita dupla se rompe, a estrutura superenrolada se solta, formando um plasmídeo circular aberto com um volume maior que migra mais lentamente durante a eletroforese e fica posicionado no topo.

DNA linear: quando ambas as fitas de DNA plasmídeo se quebram, forma-se uma estrutura linear, com um volume relativamente menor que migra mais rápido que o DNA circular aberto, mas mais lentamente que o DNA superenrolado, posicionado em segundo lugar.

DNA superenrolado: Duas hélices se entrelaçam, torcendo-se em uma estrutura superenrolada com base na hélice de DNA. Ela tem o menor volume e migra mais rápido durante a eletroforese, posicionada na parte inferior.

Análise quantitativa da proporção superenrolada

Os laboratórios usam eletroforese em gel de agarose (AGE) e o Gel-Pro Analyzer para julgar a proporção superenrolada por meio de imagens de eletroforese. Uma imagem mostra 97.539% de DNA SC, enquanto outra mostra 63.833% de DNA SC e 36.167% de DNA OC (DNA linear não visível).

O Segredo da Endotoxina nos Plasmídeos

Endotoxina é um componente da camada externa da parede celular de bactérias Gram-negativas, liberada após a morte bacteriana ou lise, contendo lipopolissacarídeo A tóxico. Durante a extração do plasmídeo, a endotoxina entra na solução de lise, afetando a eficiência da transfecção e desencadeando respostas imunes inespecíficas, levando a falsos positivos em experimentos.

Análise quantitativa e qualitativa de endotoxina

O teste de lisado de amebócito Limulus (LAL) detecta endotoxina por meio de aglutinação com ácido 2-ceto-3-desoxioctônico (KDO) no lipopolissacarídeo (LPS). É qualitativo e semiquantitativo, indicando a presença de endotoxina por meio de coagulação ou mudança de cor quando misturado com amostras.

A Yaohai Bio-Pharma oferece plasmídeos superenrolados sem endotoxinas. A terceirização para a Yaohai aumenta a eficiência de transfecção e expressão. Os plasmídeos entregues têm uma proporção de SC ≥95% (média de 85%±10%) e níveis de endotoxina ≤0.1, ≤0.01 ou ≤0.005 EU/μg.

Também procuramos ativamente parceiros globais institucionais ou individuais. Oferecemos a remuneração mais competitiva do setor. Se você tiver alguma dúvida, não hesite em nos contatar: [email protected]