Otimizando o processo de purificação de insulina humana recombinante

Nos últimos anos, o crescimento de pacientes com diabetes impulsionou a demanda por insulina, mas a insulina acessível está em falta. A produção eficiente e econômica de insulina é crucial. Produzida principalmente via Escherichia coli (E. coli) e levedura devido ao rápido crescimento e baixo custo, a E. coli enfrenta um processamento downstream complexo.

Visão geral do processamento downstream:

A purificação da insulina humana recombinante a partir de corpos de inclusão de E. coli envolve várias etapas, incluindo recuperação, lavagem, solubilização e oxidação, clivagem, troca de tampão, purificação cromatográfica, precipitação, renaturação, clivagem enzimática e formulação.

A Yaohai Bio-Pharma ostenta ampla experiência em produção e purificação de insulina recombinante, juntamente com uma equipe de especialistas, garantindo que sua produção de insulina seja concluída com alta eficiência. Aproveitando nossa experiência de centenas de projetos, a Yaohai gentilmente resume como otimizar o Processo de Purificação Downstream para Insulina Humana Recombinante.

Recuperação e Lavagem Corporal de Inclusão:

As células são rompidas usando métodos mecânicos (como ultrassonicação, homogeneização de alta pressão) ou tratamento com lisozima, seguido por tampões de lavagem (contendo ureia, Triton X-100, etc.) para remover impurezas. Durante a lavagem, os parâmetros precisam ser otimizados para garantir a qualidade da proteína enquanto controla os custos.

Solubilização e Oxidação de Corpos de Inclusão:

Desnaturantes de alta concentração (como cloridrato de guanidina e ureia) são usados ​​para solubilizar corpos de inclusão, com ditiotreitol ou β-mercaptoetanol adicionados para evitar a formação de ligações dissulfeto incorretas. O pH e a temperatura afetam significativamente as reações de solubilização e oxidação.

Clivagem e troca de buffer:

A clivagem do brometo de cianogênio é usada para remover o aminoácido iniciador N-terminal, mas apresenta problemas de toxicidade e baixa especificidade. Por meio de diálise, ultrafiltração ou cromatografia de exclusão de tamanho, a troca de tampão remove reagentes prejudiciais em preparação para operações subsequentes.

Purificação e precipitação cromatográfica:

Várias técnicas cromatográficas são empregadas para purificar insulina, incluindo cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de fase reversa, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de exclusão de tamanho. Métodos de precipitação, como precipitação de pH e cristalização de zinco, são usados ​​para remover impurezas e concentrar proteínas.

Renaturação:

A proteína solubilizada é diluída em um tampão de renaturação para promover a formação correta de ligações dissulfeto e dobramento de proteínas. Cromatografia líquida de dobramento de proteínas e diálise também são métodos usados ​​para renaturação.

Clivagem e formulação enzimática:

Tripsina e carboxipeptidase B são usadas para clivar o peptídeo C, formando o heterodímero ativo de insulina. Finalmente, a cristalização e a liofilização são empregadas para remover sais e tampões residuais, preparando uma formulação estável. Aditivos específicos (como zinco e protamina) são adicionados para atender a diferentes necessidades clínicas.

Conclusão:

Processamento a jusante da insulina de E. coli é complexo. O foco futuro deve ser otimizar essas etapas para uma produção eficiente e econômica para atender à demanda e reduzir custos.

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