Otimização da Integridade Celular de E. coli para Produção em Biotecnologia

No campo dos biofármacos, Escherichia coli (E. coli) desempenha um papel vital como hospedeiro para a expressão de proteínas recombinantes. A integridade celular da E. coli é crucial para o rendimento, qualidade e custos de produção de proteínas. Essa integridade envolve principalmente a estrutura e função da membrana interna (MI) e da membrana externa (ME).

A Yaohai Bio-Pharma possui 15 anos de experiência em fermentação de E. coli e expressão de proteínas recombinantes. Utilizamos várias estratégias para manter uma alta integridade celular da E. coli, com o rendimento de plasmídeo excedendo 1g/L dentro de um ciclo de cultivo de 30 horas. Com base na ampla experiência em expressão microbiana, a Yaohai Bio-Pharma resumiu várias estratégias eficazes para monitorar e melhorar a integridade celular da E. coli durante a produção de biofármacos.

Técnicas para Monitorar a Integridade Celular de E. coli

Citometria de Fluxo: Utiliza corantes fluorescentes para diferenciar estados celulares, como iodo propício para detectar viabilidade celular e SYTO9 para avaliar a permeabilidade da OM. No entanto, exige o alto custo de colorantes e operações complexas.

Métodos Colorimétricos: Refletem lisagem celular ao detectar conteúdo de DNA, atividades enzimáticas, etc., no sobrenadante, como usando o kit reagente PicoGreen e ensaios de atividade de fosfatase alcalina. Esses métodos, no entanto, são trabalhosos e requerem reagentes caros.

Cromatografia Líquida de Alto Desempenho: Usada para detecção offline de concentrações de produtos extracelulares para avaliar o vazamento da OM. No entanto, sua automação é complexa e o tempo de análise é longo.

Técnicas de Espectroscopia Vibracional: Como espectroscopia no infravermelho próximo e médio, que têm aplicações potenciais, mas exigem superar interferências espectrais e desafios de análise de dados.

Espectroscopia Dielétrica: Avalia a integridade da membrana medindo a impedância de suspensões celulares, permitindo monitoramento online em tempo real. No entanto, é suscetível a interferências e a calibração é difícil.

Biossensores: Podem detectar compostos vazados do interior das células ou do periplasma, mas enfrentam problemas como dificuldades de regeneração do sensor.

Medições de Viscosidade e Densidade: Baixo custo e rápido na análise, mas carecem de selectividade e exigem a consideração de dados de múltiplos lotes para julgamento.

Fatores que Afetam a Integridade Celular

Engenharia de Linhagem: Altera a integridade da OM por meio de engenharia genética, como mutação de genes de lipoproteínas, mas pode impactar o crescimento da linhagem.

Estresse Induzido: A sobreexpressão de proteínas recombinantes leva a um fardo metabólico, afetando a fisiologia celular. Portanto, é necessário um controle razoável dos níveis de expressão.

Taxa de Alimentação de Substrato: Taxas de alimentação tanto muito altas quanto muito baixas afetam a lise celular e a integridade da OM.

Temperatura e Aeração: Altas temperaturas e baixa disponibilidade de oxigênio aumentam o estresse de expressão e o vazamento de OM, respectivamente, mas os efeitos específicos variam.

Osmóticos: Usados para liberar proteínas periplasmáticas, mas danificam a viabilidade celular, limitando sua aplicação.

Conclusão: Pesquisas futuras precisam explorar mais profundamente os mecanismos e condições de reparo de membrana para controlar com precisão a integridade da membrana celular. Otimizar métodos de monitoramento e analisar fatores influenciadores devem melhorar a qualidade do produto, impulsionando o desenvolvimento da indústria biofarmacêutica.

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