Preparação de mRNA por IVT

A transcrição in vitro (IVT) é o método preferido para preparar mRNA, sendo capaz de produzir microgramas a miligramas de mRNA em uma escala laboratorial. Para fins de pesquisa, fornecedores de reagentes desenvolveram sistemas de reação IVT versáteis adequados para mRNA de comprimento moderado (1000-4000 nucleotídeos).

Neste artigo, resumiremos a transcrição in vitro (IVT) de mRNA, incluindo o sistema de reação IVT convencional usado em uma escala laboratorial e o sistema de reação IVT adequado para mRNA ultra-longo (>9000 nucleotídeos).

Os kits permitem a tampagem co-transcricional com CleanCap AG e reduzem a imunogenicidade com m1ψ. A DNase I remove DNA residual. Baixo rendimento pode ser causado por mistura inadequada, oxidação dos reagentes ou problemas no DNA do template, os quais podem ser mitigados pela centrifugação, reagentes frescos, controles e ajuste da quantidade de template/tempo de reação.

Yaohai Bio-Pharma oferece vários produtos de RNA IVT pré-fabricados (líquido/pó liofilizado) e produtos finais LNP, codificando proteínas como proteínas fluorescentes (eGFP, mCHERRY), luciferase, recombinase Cre e antígeno OVA, para atender a diferentes necessidades experimentais ou de projeto.

Sistema IVT para mRNA ultra-longo

O IVT convencional pode não funcionar para mRNA muito longo (>9000 nt). É necessário um entendimento profundo e ajustes racionais dos componentes do IVT.

Template de DNA: Plasmídeos linearizados ou produtos de PCR com sequências de promotores correspondentes, dissolvidos em H2O livre de RNase. Recomenda-se uma concentração de template de DNA superior a 40 nM para condições ótimas de IVT.

DTT: Mantém a atividade enzimática durante a transcrição. DTT fresco deve ser adicionado ao buffer de reação para manter a atividade enzimática ótima.

Inibidor de RNase: Inibe a atividade de RNase e mantém a estabilidade do mRNA.

Polimerase T7 RNA: Catalisa a transcrição de DNA em RNA, correspondente à sequência do promotor. A atividade da polimerase de RNA T7 é afetada pelo pH e íons de magnésio.

Íons de Magnésio (Mg2+): Um cofator para a polimerase de RNA. Concentrações muito baixas reduzem a eficiência de transcrição, enquanto concentrações muito altas levam à degradação do RNA. O [Mg2+] livre deve ser ajustado com base na concentração de nucleotídeos. Cada nucleotídeo quelata um [Mg2+], então a concentração de [Mg2+] deve exceder a concentração total de nucleotídeos.

Tri-fosfatos de Nucleosídeos (NTP): Como substratos, os NTPs são as unidades básicas do RNA. Concentrações de NTP acima de 7 mM têm um impacto positivo na produção de mRNA.

Spermidina: Estabiliza complexos DNA-enzima e estimula reações de transcrição; no entanto, concentrações excessivas têm efeitos inibitórios. A concentração recomendada de spermidina está entre 1 e 3 mM.

Pirofosfatase Inorgânica (PPase): Adicionado às reações de IVT para prevenir o acúmulo de íons de pirrofosfato inorgânico (PPi), evitando sua quelação com Mg2+ e garantindo quantidade suficiente de Mg2+ livre.

Aproveitando tecnologia pioneira e experiência em mRNA de IVT, a Yaohai Bio-Pharma oferece um serviço completo de RNA de IVT, abrangendo design de sequências, preparação de RNA de IVT (com mods de m1ψ), ciclização de RNA, purificação, liofilização, encapsulamento em LNP e testes de qualidade.

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