Preparação de mRNA IVT

A transcrição in vitro (IVT) é o método preferido para preparar mRNA, capaz de produzir microgramas a miligramas de mRNA em escala laboratorial. Para fins de pesquisa, os fornecedores de reagentes desenvolveram sistemas de reação IVT versáteis adequados para mRNA de comprimento moderado (1000-4000 nucleotídeos).

Neste artigo, resumiremos a transcrição in vitro (IVT) de mRNA, incluindo o sistema de reação IVT convencional usado em escala laboratorial e o sistema de reação IVT adequado para mRNA ultralongo (>9000 nucleotídeos).

Os kits permitem o capeamento cotranscricional com CleanCap AG e reduzem a imunogenicidade com m1ψ. A DNase I remove o DNA residual. O baixo rendimento pode ser devido à mistura ruim, oxidação do reagente ou problemas com o modelo de DNA, que podem ser mitigados por centrifugação, reagentes frescos, controles e ajuste da quantidade do modelo/tempo de reação.

A Yaohai Bio-Pharma fornece vários produtos pré-fabricados de RNA IVT (pó líquido/liofilizado) e produtos acabados de LNP, codificando proteínas como proteínas fluorescentes (eGFP, mCHERRY), luciferase, recombinase Cre e antígeno OVA, para atender a diferentes necessidades experimentais ou de projetos.

Sistema IVT para mRNA ultralongo

IVT convencional pode não funcionar para mRNA muito longo (>9000 nt). Uma compreensão profunda e ajuste racional dos componentes de IVT são necessários.

Modelo de DNA: Plasmídeos linearizados ou produtos de PCR com sequências promotoras correspondentes, dissolvidos em H2O livre de RNase. Uma concentração de molde de DNA maior que 40 nM é recomendada para condições ótimas de IVT.

TDT: Mantém a atividade enzimática durante a transcrição. DTT fresco deve ser adicionado ao tampão de reação para atividade enzimática ótima.

Inibidor de RNase: Inibe a atividade da RNase e mantém a estabilidade do mRNA.

T7 RNA Polimerase: Catalisa a transcrição de DNA em RNA, correspondendo à sequência promotora. A atividade da T7 RNA polimerase é afetada pelo pH e íons de magnésio.

Íons de magnésio (Mg2+): Um cofator para RNA polimerase. Concentrações muito baixas reduzem a eficiência da transcrição, enquanto concentrações muito altas levam à degradação do RNA. O [Mg2+] livre deve ser ajustado com base na concentração de nucleotídeos. Cada nucleotídeo quela um [Mg2+], então a concentração de [Mg2+] deve exceder a concentração total de nucleotídeos.

Trifosfatos de nucleosídeos (NTP): Como substratos, NTPs são as unidades básicas do RNA. Concentrações de NTP acima de 7 mM têm um impacto positivo na produção de mRNA.

Espermidina: Estabiliza complexos de enzimas de DNA e estimula reações de transcrição; no entanto, concentrações excessivas têm efeitos inibitórios. A concentração recomendada de espermidina é entre 1 e 3 mM.

Pirofosfatase inorgânica (PPase): Adicionado às reações IVT para evitar o acúmulo de íons pirofosfato inorgânicos (PPi), evitando sua quelação com Mg2+ e garantindo Mg2+ livre suficiente.

Aproveitando a tecnologia pioneira e a experiência em mRNA IVT, a Yaohai Bio-Pharma fornece um serviço completo de RNA IVT, abrangendo design de sequência, preparação de RNA IVT (com mods m1ψ), ciclização de RNA, purificação, liofilização, encapsulamento de LNP e testes de qualidade.

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