Aproveitando o poder da estratégia de fermentação em lote alimentado

Pichia pastoris é amplamente usada na produção de várias proteínas heterólogas. A tecnologia de Fermentação de Alta Densidade Celular (HCDF), implementada por meio da alimentação Fed-Batch, alcançou com sucesso a produção em larga escala de biofármacos e enzimas industriais. Em meios precisamente controlados, a utilização da tecnologia HCDF pode obter proteínas recombinantes de alto rendimento, alta atividade e custo-efetivas.

Pesquisas recentes indicam que, por meio de estratégias de HCDF, esforços estão sendo feitos para aumentar a produção e a atividade de proteínas heterólogas em Pichia pastoris. A tecnologia de HCDF permite a obtenção sem esforço de clusters de células de alto nível em meios definidos, permitindo assim a aquisição de proteínas recombinantes abundantes com atividade aprimorada e custos reduzidos por meio de HCDF. No entanto, selecionar a estratégia de HCDF apropriada para otimizar a expressão de alto nível de proteínas específicas em Pichia pastoris continua sendo um desafio.

Fermentação de alta densidade celular (HCDF)

Pichia pastoris se destaca na produção de proteína heteróloga, favorecida para HCDF em biorreatores automatizados. HCDF tem 3 estágios: lote de glicerol, alimentação e indução de metanol. Yaohai Bio-Pharma ostenta mais de uma década de experiência em fermentação microbiana e atendeu a mais de 400 projetos. A empresa possui ampla experiência e tecnologia bem desenvolvida, permitindo que ela utilize várias estratégias de HCDF para melhorar a eficiência da produção de proteína.

O metanol serve tanto como um indutor de AOX1 quanto como uma fonte de carbono, mas sua concentração deve ser controlada para evitar toxicidade. Avaliar diferentes estratégias de alimentação de metanol é crucial para otimizar o crescimento de Pichia pastoris e a expressão de proteína

Estratégia de indução de metanol

Na estratégia de indução de metanol HCDF fed-batch, as estratégias de indução baseadas em estado abrangem um conjunto de metodologias de controle que regulam a adição suplementar de metanol por meio de controle online/offline ou direto/reverso. Entre as estratégias de indução estatística, as principais incluem μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat e biomass-stat.

1.1 μ-estat

A estratégia μ-stat mantém a biomassa estável controlando μ, auxiliando a reprodutibilidade e estudando o efeito de μ na expressão de proteína. No entanto, ela não tem controle direto de metanol e OD, arriscando acúmulo e geração de ROS.

1.2 DO-stat

A estratégia DO-stat regula indiretamente a alimentação de metanol controlando o oxigênio dissolvido para manter a oxigenação, mas não fixa a concentração de metanol e a taxa de crescimento, o que pode afetar o estudo da expressão de proteína. A oxigenação representa um desafio na fermentação aeróbica e, embora a suplementação de oxigênio puro possa ser cara e tóxica, o aumento da pressão é uma abordagem mais econômica que também pode aumentar a atividade da proteína.

1.3 Metanol-stat

O controle inadequado da concentração de metanol impõe limitações às estratégias μ-stat e DO-stat. As estratégias estatísticas de metanol, que operam em um modo on/off, são propensas a flutuações e carecem de precisão. Em contraste, os controladores PID oferecem uma regulação mais precisa da concentração de metanol, aumentando a eficácia geral da fermentação.

1.4 Biomassa-stat

A estratégia biomass-stat define a relação entre biomassa e alimentação de metanol, otimizando a taxa de alimentação de metanol para aumentar o rendimento de proteína. O monitoramento on-line da biomassa é mais prático, com citometria de fluxo sendo o método preferido. Em uma escala de 1000L, otimizar a taxa de alimentação de metanol melhora significativamente a atividade enzimática, o rendimento e a produtividade, superando a fermentação em frasco.

Estratégia de coalimentação

O glicerol, como um inibidor do promotor AOX1, deve ser totalmente consumido antes da indução do metanol para evitar a supressão da produção de proteína. Os co-substratos podem aumentar a atividade enzimática, mas o excesso de glicerol pode prejudicar o crescimento e a expressão. Sorbitol, ácido ascórbico, manitol e outros podem substituir o glicerol, reduzindo a proteólise e o tempo de cultivo, e aumentando a expressão da proteína.

O banco de cepas necessita adotar métodos de preservação apropriados e colocação em um ambiente adequado para manter a estabilidade das características da cepa. A Yaohai Bio-Pharma pode atender aos requisitos para preservação de estoque de glicerol (por meio de freezers de temperatura ultrabaixa ou nitrogênio líquido) e preservação por liofilização de levedura e E. coli.

Estratégia induzida por restrição

Em Pichia pastoris, condições restritivas como baixo OD, concentração de metanol e limite de oxigênio aumentam a expressão de proteína recombinante. Condições limitadas de oxigênio ativam o promotor AOX1 por meio do acúmulo de metanol, aumentando a produção de proteína enquanto reduz o calor. A indução de baixa temperatura aumenta o rendimento, a atividade, a estabilidade e a viabilidade celular, mas adiciona custos de resfriamento. A limitação de pH e nitrogênio também auxilia na expressão, exigindo cautela para evitar problemas operacionais. A limitação de nitrogênio aumenta notavelmente a produtividade específica de proteína.

A Yaohai Bio-Pharma também está buscando ativamente parceiros globais institucionais ou individuais e oferece a remuneração mais competitiva do setor. Se você tiver alguma dúvida, sinta-se à vontade para entrar em contato conosco: [email protected]