Utilizando o Poder da Estratégia de Fermentação Fed-batch

Pichia pastoris é amplamente utilizada na produção de vários proteínas heterólogas. A tecnologia de Fermentação de Alta Densidade Celular (HCDF), implementada por meio de alimentação Fed-Batch, obteve sucesso na produção em larga escala de biofármacos e enzimas industriais. Em meios de cultura controlados com precisão, a utilização da tecnologia HCDF pode obter proteínas recombinantes de alta produtividade, alta atividade e baixo custo.

Pesquisas recentes indicam que, por meio de estratégias HCDF, estão sendo feitos esforços para aumentar a produção e a atividade de proteínas heterólogas em Pichia pastoris. A tecnologia HCDF permite a obtenção fácil de altos níveis de agregados celulares em meios definidos, permitindo assim a obtenção de abundantes proteínas recombinantes com atividade aprimorada e custos reduzidos através do HCDF. No entanto, selecionar a estratégia HCDF adequada para otimizar a expressão de alto nível de proteínas específicas em Pichia pastoris ainda é um desafio.

Fermentação de Alta Densidade Celular (HCDF)

Pichia pastoris se destaca na produção de proteínas heterólogas, sendo favorecida para HCDF em biorreatores automatizados. O HCDF tem 3 etapas: lote de glicerol, alimentação e indução com metanol. A Yaohai Bio-Pharma possui mais de uma década de experiência em fermentação microbiana e já atendeu mais de 400 projetos. A empresa detém ampla expertise e tecnologia bem desenvolvida, permitindo-lhe utilizar várias estratégias de HCDF para melhorar a eficiência da produção de proteínas.

O metanol serve tanto como indutor do AOX1 quanto como fonte de carbono, mas sua concentração deve ser controlada para evitar toxicidade. Avaliar diferentes estratégias de alimentação com metanol é crucial para otimizar o crescimento de Pichia pastoris e a expressão de proteínas.

Estratégia de indução com metanol

Na estratégia de indução de metanol em HCDF em lote alimentado, estratégias de indução baseadas em estado abrangem um conjunto de metodologias de controle que regulam a adição suplementar de metanol por meio de controle online/offline ou avançado/reverso. Entre as estratégias estatísticas de indução, as principais incluem μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, metanol-stat e biomass-stat.

1.1 μ-stat

a estratégia μ-stat mantém o biomassa estável controlando μ, auxiliando na reprodutibilidade e no estudo do efeito de μ na expressão de proteínas. No entanto, ela não possui controle direto de metanol e DO, correndo o risco de acúmulo e geração de ROS.

1.2 DO-stat

A estratégia DO-stat regula indiretamente a alimentação de metanol controlando o oxigênio dissolvido para manter a oxigenação, mas não fixa a concentração de metanol e a taxa de crescimento, o que pode afetar o estudo da expressão de proteínas. A oxigenação apresenta um desafio na fermentação aeróbica, e enquanto a suplementação de oxigênio puro pode ser custosa e tóxica, o aumento de pressão é uma abordagem mais econômica que também pode melhorar a atividade da proteína.

1.3 Methanol-stat

O controle inadequado da concentração de metanol impõe limitações tanto à estratégia μ-stat quanto à DO-stat. As estratégias estatísticas de metanol, que operam em um modo ligado/desligado, estão sujeitas a flutuações e carecem de precisão. Em contraste, os controladores PID oferecem uma regulagem mais precisa da concentração de metanol, melhorando a eficácia geral da fermentação.

1.4 Biomassa-stat

A estratégia biomass-stat define a relação entre biomassa e alimentação de metanol, otimizando a taxa de alimentação de metanol para aumentar o rendimento de proteína. O monitoramento online da biomassa é mais prático, com citometria de fluxo sendo o método preferido. Em uma escala de 1000L, otimizar a taxa de alimentação de metanol melhora significativamente a atividade enzimática, o rendimento e a produtividade, superando a fermentação em frascos.

Estratégia de co-alimentação

Glicerol, como inibidor do promotor AOX1, deve ser totalmente consumido antes da indução com metanol para evitar suprimir a produção de proteína. Co-substratos podem aumentar a atividade enzimática, mas um excesso de glicerol pode prejudicar o crescimento e a expressão. Sorbitol, ácido ascórbico, manitol e outros podem substituir o glicerol, reduzindo a proteólise e o tempo de cultivo, e melhorando a expressão de proteínas.

O banco de cepas exige a adoção de métodos adequados de preservação e colocação em um ambiente adequado para manter a estabilidade das características das cepas. A Yaohai Bio-Pharma pode atender aos requisitos para preservação de estoques de glicerol (via freezers de ultra-baixa temperatura ou nitrogênio líquido) e preservação por liofilização de leveduras e E. coli.

Estratégia induzida por restrição

Em Pichia pastoris, condições restritivas como baixo DO, concentração de metanol e limite de oxigênio aumentam a expressão de proteínas recombinantes. Condições com limite de oxigênio ativam o promotor AOX1 via acúmulo de metanol, aumentando a produção de proteínas enquanto reduzem o calor. Indução a baixa temperatura melhora o rendimento, atividade, estabilidade e viabilidade celular, mas adiciona custos de resfriamento. O pH e a limitação de nitrogênio também auxiliam na expressão, exigindo cautela para evitar problemas operacionais. A limitação de nitrogênio aumenta significativamente a produtividade específica de proteínas.

Yaohai Bio-Pharma também está ativamente buscando parceiros globais institucionais ou individuais e oferece a compensação mais competitiva do setor. Se tiver alguma dúvida, sinta-se à vontade para nos contatar: [email protected]