Métodos de modificação do RNA repórter de defesa

Ao escolher qual método de modificações de mRNA repórter é preferível, não há uma resposta definitiva, pois cada método e gene repórter tem suas próprias vantagens e cenários aplicáveis. Aqui estão alguns métodos comuns de modificação de mRNA e genes repórter, juntamente com suas características e adequação.

Métodos de modificação de mRNA

Metilação:

1. m6A: Associado à estabilidade do mRNA, splicing, tradução e processamento de miRNA. Os desafios de detecção incluem seleção e localização de anticorpos.
2. 5' Tampa Nm: Aumenta a estabilidade, splicing, poliadenilação e exportação nuclear. Ajuda a distinguir o RNA próprio do RNA estranho.
3. Pseudouridilação: Altera códons, aumenta a estabilidade e responde ao estresse. Catalisado por pseudouridina sintases.

Introduções de nucleotídeos não naturais:

1. Introduzido durante a transcrição com uma estratégia de modificação química dupla. Ele aumenta a estabilidade, eficiência e expressão de proteína.

Genes Repórteres

1. Gene da proteína fluorescente verde (GFP): Vantagens: Fácil de detectar, propriedades de fluorescência estáveis, não tóxico para células, adequado para imagens de células vivas. Desvantagens: Intensidade de fluorescência limitada.
2. Proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP): Vantagens: Mais de 6 vezes mais brilhante que o GFP selvagem, tornando-o mais adequado como um gene repórter para estudar expressão gênica, regulação, diferenciação celular e localização e transporte de proteínas dentro de organismos.
3. Proteínas fluorescentes vermelhas (por exemplo, mCherry): Vantagens: Comprimentos de onda de excitação e emissão mais longos, resultando em menor ruído de fundo durante a imagem intracelular, excelente brilho de fluorescência e fotoestabilidade, e menor toxicidade celular. Desvantagens: Pode não ser tão comumente usado quanto GFP em certas condições experimentais.
4. Luciferase de vaga-lume: Vantagens: Na presença de ATP, íons de magnésio e oxigênio, ele pode catalisar a oxidação da luciferina em oxiluciferina, emitindo bioluminescência. É adequado para uso como controle para estudar a eficiência da tradução de genes alvo em células de mamíferos, viabilidade celular e ensaios de imagem in vivo.

Conclusão

Ao escolher qual método de modificações de mRNA repórter é preferível, isso depende de objetivos experimentais específicos, antecedentes de pesquisa e condições experimentais. Por exemplo, se for necessária alta sensibilidade, eGFP pode ser uma escolha melhor. Se for necessária a geração de imagens em comprimentos de onda maiores para reduzir a interferência de fundo, proteínas fluorescentes vermelhas como mCherry podem ser mais adequadas. Além disso, com base nas necessidades específicas de modificação do mRNA (por exemplo, aumentando a estabilidade, melhorando a eficiência da tradução), o método de modificação correspondente pode ser selecionado.

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