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mRNAポリAの特性評価

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mRNA 3'ポリ(A)の特性

mRNA 3'ポリ(A)の特性

mRNA の 3' ポリ (A) テール (ポリアデノシン) は、転写後調節に不可欠であり、mRNA の輸出、安定性、翻訳に影響を及ぼします。in vitro 転写 (IVT) mRNA の場合、ポリ (A) テールは、共転写中にテンプレート方式で導入されるか、または酵素によるテーリング プロセスを通じて非テンプレート方式で導入されます。この 3' ポリ (A) は、IVT RNA の重要な品質特性 (CQA) として機能し、プロセス開発とバッチ リリースの両方で徹底した特性評価が必要になります。

Yaohai Bio-Pharma は、リボヌクレアーゼ T3 (RNase T1) 切断、イオンペア逆相高性能液体クロマトグラフィー (IP-RP-HPLC)/液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS)、包括的なデータ分析などの技術を採用した、専門的な 1' ポリ (A) 特性評価サービスを提供しています。

mRNA 3'ポリ(A)特性評価に関する規制要件

WHO の規制上の考慮事項によると、「mRNA の構造の完全性は、mRNA の放出にとって重要な品質特性であると考えられています。したがって、mRNA の完全性、5' キャッピング効率、3' ポリ (A) テールの存在または長さなどの制御が必要です。」

分析方法

分析

メソッド

mRNA 3'ポリ(A)の特性評価

L消化後のC-MS
手順
ステップ1. RNase T1切断

LC-MS による完全な mRNA の直接分析は、そのサイズと不均一性のため実用的ではありません。ポリ (A) テールを調べるには、それを完全長 mRNA から切断する必要があります。一般的な方法は、RNase T1 による酵素消化で、ポリ (A) 配列を保存しながら rG の 3' 末端を選択的に切断します。mRNA サンプルは RNase T1 で消化され、ポリ (A) ストレッチを含む切断フラグメントはオリゴ dT でコーティングされた磁気ビーズを使用して分離されます。

ステップ2. IP-RP-HPLC/LC-MS

抽出されたテールは LC-MS を使用して分析され、単一ヌクレオチドの分解能で正確なテールの長さの情報が得られました。オリゴヌクレオチド LC-MS 分析では、アミン移動相添加剤を使用したイオン対逆相 (IP-RP) 分離が、その強力な分解能と質量分析 (MS) との互換性により、好ましいクロマトグラフィー モードとなっています。

ステップ3. データ分析

ポリ(A)テールの長さとその相対的な存在量は、ピークの数と強度をアデノシンの質量で割った値によって決まります。質量スペクトルを処理またはデコンボリューションすると、100 mer ポリ(A)テールの予測質量 (ボックス内の 33,163 Da) が識別され、アデノシン (A) の質量に相当する 329 amu 間隔の一連の質量が伴います。

LC-MSによる3'ポリ(A)の特性評価の事例

Yaohai-BioPharma は、RNase T3 切断および IP-RP-HPLC/LC-MS を含む、mRNA 1' ポリ (A) 特性評価のための堅牢な方法を開発しました。

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Yaohai-BioPharma は、RNase T3 切断および IP-RP-HPLC/LC-MS を含む、mRNA 1' ポリ (A) 特性評価のための堅牢な方法を開発しました。

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