mRNA 3' poli(A) Karakterizacija
mRNA 3' poli(A) Karakterizacija
3' poli(A) rep (poliadenozini) mRNA sastavni je dio posttranskripcijske regulacije, utječući na izvoz, stabilnost i translaciju mRNA. U slučaju in vitro transkribiranih (IVT) mRNA, poli(A) rep se uvodi ili tijekom ko-transkripcije na šablonski način ili kroz enzimski repni proces na nešablonski način. Ovaj 3' poli(A) služi kao kritični atribut kvalitete (CQA) za IVT RNA, zahtijevajući temeljitu karakterizaciju tijekom razvoja procesa i puštanja serije.
Yaohai Bio-Pharma pruža specijalizirane usluge karakterizacije 3' poli(A) koristeći tehnike kao što su cijepanje ribonukleazom T1 (RNase T1), tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti reverzne faze ionskih parova (IP-RP-HPLC)/tekućinska kromatografija-masena spektrometrija (LC-MS), te sveobuhvatnu analizu podataka.
Regulatorni zahtjevi za karakterizaciju mRNA 3' poli(A).
Prema regulatornim razmatranjima WHO-a, “integritet strukture mRNA smatra se kritičnim atributom kvalitete za otpuštanje mRNA. Stoga je potrebna kontrola za integritet mRNA, učinkovitost zatvaranja 5', prisutnost ili duljinu repa 3' poli(A) i tako dalje.”
Analitička metoda
Analiza |
Metode |
mRNA 3' poli(A) karakterizacija |
LC-MS nakon probave |
Postupak
Korak 1. RNaza T1 cijepanje
Izravna analiza intaktne mRNA pune duljine pomoću LC-MS nepraktična je zbog njezine veličine i heterogenosti. Da bi se ispitao poli(A) rep, mora se odcijepiti od mRNA pune duljine. Prevladavajuća metoda uključuje enzimatsku probavu s RNazom T1, selektivno cijepajući 3' kraj rG uz očuvanje poli(A) sekvence. Uzorak mRNA podvrgava se digestiji s RNazom T1, a fragmenti cijepanja koji sadrže poli(A) dionice se izoliraju korištenjem magnetskih kuglica obloženih oligo dT.
Korak 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Ekstrahirani repovi podvrgnuti su analizi pomoću LC-MS, nudeći precizne informacije o duljini repa u rezoluciji jednog nukleotida. U oligonukleotidnoj LC-MS analizi, odvajanje reverzne faze ionskim parom (IP-RP) s aditivima mobilne faze amina predstavlja poželjan kromatografski način, zahvaljujući njihovoj snažnoj moći razlučivanja i kompatibilnosti s masenom spektrometrijom (MS).
Korak 3. Analiza podataka
Duljina poli(A) repa i njegova relativna zastupljenost ovise o broju i intenzitetu vrhova podijeljenih s masom adenozina. Nakon obrade ili dekonvolucije masenog spektra, razaznaje se očekivana masa 100-mer poli(A) repa (33,163 Da u kutiji), popraćena nizom masa razmaknutih od 329 amu, što je ekvivalentno masi adenozina (A) .
Slučaj 3' poli(A) karakterizacije s LC–MS
Yaohai-BioPharma je razvila robusnu metodu za karakterizaciju mRNA 3' poli(A), uključujući cijepanje RNazom T1 i IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma je razvila robusnu metodu za karakterizaciju mRNA 3' poli(A), uključujući cijepanje RNazom T1 i IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
