Učinkovitost zatvaranja mRNA 5'
Značaj analize učinkovitosti zatvaranja mRNA 5'
Kapa struktura smještena na 5' kraju mRNA igra ključnu ulogu u učinkovitom prevođenju, stabilizaciji i transportu mRNA unutar eukariota. U kontekstu in vitro transkribirane (IVT) mRNA, 5' kapa se uvodi bilo ko-transkripcijskim zatvaranjem ili enzimatskim procesima zatvaranja. Kao neizostavna komponenta IVT RNA, 5' kapa predstavlja kritični atribut kvalitete (CQA) koji zahtijeva sveobuhvatnu karakterizaciju tijekom razvoja procesa i izdavanja serije.
Yaohai-Bio Pharma pruža sveobuhvatna rješenja za analizu učinkovitosti zatvaranja od 5', uključujući dizajn oligonukleotidnih udlaga (sonde), cijepanje RNazom H, IP-RP-Ion-pair reverzno-faznu tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti (IP-RP-HPLC)/tekućinsku kromatografiju -masena spektrometrija (LC-MS), analiza podataka.
Regulatorni zahtjevi za integritet mRNA
Prema regulatornim razmatranjima WHO-a, “integritet strukture mRNA smatra se kritičnim atributom kvalitete za otpuštanje mRNA. Stoga je potrebna kontrola za integritet mRNA, učinkovitost zatvaranja 5', prisutnost ili duljinu repa 3' poli(A) i tako dalje.”
Analitička metoda
Analiza | Metode |
Učinkovitost zatvaranja mRNA 5' | LC-MS nakon probave |
Postupak
Korak 1. Dizajn oligonukleotidnih udlaga (sonde).
Proba za cijepanje, koja uključuje 2'-O-metilnukleotide i tetradeoksiribonukleotide, služi za cijepanje komplementarnog lanca RNA na određenim položajima kada je prisutna RNaza H. Ova se metoda pokazala vrlo vrijednom za ciljano stvaranje većih fragmenata RNA.
Korak 2. RNaza H cijepanje
Biotinilirana sonda, strateški dizajnirana da bude komplementarna 5' kraju mRNA, primjenjuje se zajedno s RNazom H za kataliziranje ciljanog cijepanja 5' kraja oligonukleotida koji posjeduje kapu strukturu.
Korak 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
U oligonukleotidnoj LC-MS analizi, poželjni kromatografski način je odvajanje reverzne faze ionskim parom (IP-RP) korištenjem aditiva mobilne faze amina. To se pripisuje njihovoj superiornoj moći razlučivosti i kompatibilnosti s masenom spektrometrijom (MS).
Korak 4. Analiza podataka
Različite mase uočene u fragmentima cijepanja koji imaju m7GpppG kapu, za razliku od onih s difosfatnom, trifosfatnom ili nemetiliranom G kapom (GpppG), olakšavaju njihovu identifikaciju i omogućuju procjenu učinkovitosti zatvaranja.
Slučaj analize učinkovitosti zatvaranja s LC–MS
Yaohai-Bio Pharma razvila je robusne metode za analizu učinkovitosti zatvaranja mRNA, od dizajna oligonukleotidnih udlaga (sonde), cijepanja RNazom H, IP-RP-HPLC/LC-MS do analize podataka.
Ukupni ionski kromatogrami (lijevo) i maseni spektri elektrospreja (desno) fragmenata cijepanja na 5' kraju
EN
