mRNA:n 3' poly(A) karakterisointi
mRNA:n 3' poly(A) karakterisointi
mRNA:n 3'-poly(A)-häntä (polyadenosiinit) on kiinteä osa transkription jälkeistä säätelyä, mikä vaikuttaa mRNA:n vientiin, stabiilisuuteen ja translaatioon. In vitro -transkriptoitujen (IVT) mRNA:iden tapauksessa poly(A)-häntä lisätään joko yhteistranskription aikana temploidulla tavalla tai entsymaattisen hännänmuodostusprosessin kautta temploitumattomalla tavalla. Tämä 3′ poly(A) toimii kriittisenä laatuattribuuttina (CQA) IVT RNA:ille, mikä edellyttää perusteellista karakterisointia sekä prosessin kehittämisen että erän vapauttamisen aikana.
Yaohai Bio-Pharma tarjoaa erikoistuneita 3' poly(A) karakterisointipalveluita, joissa käytetään tekniikoita, kuten ribonukleaasi T1 (RNase T1) pilkkominen, ionipari käänteisfaasi korkean suorituskyvyn nestekromatografia (IP-RP-HPLC)/nestekromatografia-massaspektrometria. (LC-MS) ja kattava data-analyysi.
Sääntelyvaatimukset mRNA:n 3' poly(A) karakterisointia varten
WHO:n säädösten mukaan "mRNA:n rakenteen eheyttä pidetään kriittisenä laatutekijänä mRNA:n vapautumiselle. Siten valvontaa tarvitaan mRNA:n eheydelle, 5′ capping -tehokkuudelle, 3′ poly(A) hännän läsnäololle tai pituudelle ja niin edelleen.
Analyyttinen menetelmä
analyysi |
Menetelmät |
mRNA:n 3' poly(A) karakterisointi |
LC-MS ruoansulatuksen jälkeen |
menettely
Vaihe 1. RNaasi T1 -katkaisu
Täyspitkän ehjän mRNA:n suora analyysi LC-MS:llä on epäkäytännöllistä sen koon ja heterogeenisyyden vuoksi. Poly(A)-hännän tutkimiseksi se on katkaistava täyspitkästä mRNA:sta. Yleisin menetelmä sisältää entsymaattisen pilkkomisen RNaasi T1:llä, joka katkaisee selektiivisesti rG:n 3'-pään säilyttäen samalla poly(A)-sekvenssin. mRNA-näyte pilkotaan RNaasi T1:llä, ja poly(A)-jaksoja sisältävät katkaisufragmentit eristetään käyttämällä oligo-dT-päällystettyjä magneettihelmiä.
Vaihe 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Uutetut hännät analysoitiin LC-MS:llä, mikä tarjoaa tarkat hännänpituustiedot yhden nukleotidin resoluutiolla. Oligonukleotidi-LC-MS-analyysissä ionipariutuvat käänteisfaasi- (IP-RP) -erotukset amiinin liikkuvan faasin lisäaineilla ovat edullisin kromatografiamuoto, mikä johtuu niiden vahvasta erotuskyvystä ja yhteensopivuudesta massaspektrometrian (MS) kanssa.
Vaihe 3. Tietojen analysointi
Poly(A) hännän pituus ja sen suhteellinen runsaus riippuvat piikkien lukumäärästä ja intensiteetistä jaettuna adenosiinin massalla. Massaspektrin prosessoinnin tai dekonvoluution yhteydessä havaitaan 100-meerisen poly(A) hännän (33,163 329 Da laatikossa) odotettu massa, johon liittyy joukko massoja XNUMX amu:n välein, mikä vastaa adenosiinin (A) massaa. .
3' poly(A) -karakterisointi LC-MS:llä
Yaohai-BioPharma on kehittänyt vankan menetelmän mRNA:n 3'-poly(A):n karakterisointiin, mukaan lukien RNaasi T1:n pilkkominen ja IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma on kehittänyt vankan menetelmän mRNA:n 3'-poly(A):n karakterisointiin, mukaan lukien RNaasi T1:n pilkkominen ja IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
