mRNA:n 5'-suojaustehokkuus
mRNA:n 5'-suojauksen tehokkuusanalyysin merkitys
mRNA:n 5'-päässä sijaitsevalla korkkirakenteella on keskeinen rooli mRNA:iden tehokkaassa translaatiossa, stabiloinnissa ja kuljetuksessa eukaryooteissa. In vitro -transkriptoidun (IVT) mRNA:n yhteydessä 5' cap viedään joko yhteistranskription kappausprosessin tai entsymaattisen capping-prosessin kautta. IVT-RNA:iden välttämättömänä komponenttina 5′-korkki on kriittinen laatuominaisuus (CQA), joka edellyttää kattavaa karakterisointia prosessin kehittämisen ja erän vapauttamisen ajan.
Yaohai-Bio Pharma tarjoaa kattavat 5' capping -tehokkuusanalyysiratkaisut, jotka sisältävät oligonukleotidilastujen (koetin) suunnittelun, RNaasi H -pilkkomisen, IP-RP-ioniparin käänteisfaasin korkean suorituskyvyn nestekromatografian (IP-RP-HPLC)/nestekromatografian -massaspektrometria (LC-MS), data-analyysi.
Sääntelyvaatimukset mRNA:n eheydelle
WHO:n säädösten mukaan "mRNA:n rakenteen eheyttä pidetään kriittisenä laatutekijänä mRNA:n vapautumiselle. Siten valvontaa tarvitaan mRNA:n eheydelle, 5′ capping -tehokkuudelle, 3′ poly(A) hännän läsnäololle tai pituudelle ja niin edelleen.
Analyyttinen menetelmä
analyysi |
Menetelmät |
mRNA:n 5'-suojaustehokkuus |
LC-MS ruoansulatuksen jälkeen |
menettely
Vaihe 1. Oligonukleotidilasta (koetin) suunnittelu
Katkaisukoetin, joka sisältää 2'-O-metyylinukleotidit ja tetradeoksiribonukleotidit, katkaisee komplementaarisen RNA-juosteen spesifisistä kohdista, kun RNaasi H on läsnä. Tämä menetelmä osoittautuu erittäin arvokkaaksi suurempien RNA-fragmenttien kohdistetussa generoinnissa.
Vaihe 2. RNaasi H:n pilkkominen
Biotinyloitua koetinta, joka on strategisesti suunniteltu komplementaariseksi mRNA:n 5'-pään kanssa, käytetään yhdessä RNaasi H:n kanssa katalysoimaan 5'-pään oligonukleotidin, jolla on cap-rakenne, kohdennettu pilkkoutuminen.
Vaihe 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Oligonukleotidi-LC-MS-analyysissä edullinen kromatografinen tapa on ionipariutuva käänteisfaasi (IP-RP) -erotus, jossa käytetään liikkuvan faasin amiinilisäaineita. Tämä johtuu niiden erinomaisesta erotuskyvystä ja yhteensopivuudesta massaspektrometrian (MS) kanssa.
Vaihe 4. Tietojen analysointi
Sellaiset massat, jotka havaitaan pilkkoutumisfragmenteissa, joissa on m7GpppG-kanta, toisin kuin ne, joissa on difosfaatti-, trifosfaatti- tai metyloitumaton G-kapseli (GpppG), helpottavat niiden tunnistamista ja mahdollistavat rajoituksen tehokkuuden arvioinnin.
Tapaus rajauksen tehokkuuden analyysistä LC-MS:llä
Yaohai-Bio Pharma on kehittänyt vankkoja menetelmiä mRNA:n rajauksen tehokkuusanalyysiin, oligonukleotidilastujen (koetin) suunnittelusta, RNaasi H:n pilkkomisesta, IP-RP-HPLC/LC-MS:stä data-analyysiin.
5'-pään pilkkoutumisfragmenttien kokonaisionikromatogrammit (vasemmalla) ja sähkösumutusmassaspektrit (oikealla)
EN
