mRNA 3' polü(A) iseloomustus
mRNA 3' polü(A) iseloomustus
MRNA 3' polü(A) saba (polüadenosiinid) on transkriptsioonijärgse regulatsiooni lahutamatu osa, mõjutades mRNA eksporti, stabiilsust ja translatsiooni. In vitro transkribeeritud (IVT) mRNA-de puhul sisestatakse polü(A) saba kas kaastranskriptsiooni ajal matriitsiga või ensümaatilise sabamisprotsessi kaudu mitte-matriitsilisel viisil. See 3′ polü(A) toimib IVT RNA jaoks kriitilise kvaliteediatribuutina (CQA), mis nõuab põhjalikku iseloomustamist nii protsessi arendamise kui ka partii vabastamise ajal.
Yaohai Bio-Pharma pakub spetsiaalseid 3' polü(A) iseloomustamisteenuseid, kasutades selliseid meetodeid nagu ribonukleaas T1 (RNase T1) lõhustamine, ioonpaari pöördfaasiline kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (IP-RP-HPLC)/vedelikkromatograafia-massispektromeetria (LC-MS) ja põhjalik andmete analüüs.
Regulatiivsed nõuded mRNA 3' polü(A) iseloomustusele
WHO regulatiivsete kaalutluste kohaselt peetakse mRNA struktuuri terviklikkust mRNA vabanemise kriitiliseks kvaliteediatribuudiks. Seega on kontroll vajalik mRNA terviklikkuse, 5′ piiramise efektiivsuse, 3′ polü(A) saba olemasolu või pikkuse ja nii edasi.
Analüütiline meetod
Analüüs |
Meetodid |
mRNA 3' polü(A) iseloomustus |
LC-MS pärast seedimist |
Menetlus
Etapp 1. RNaasi T1 lõhustamine
Täispika intaktse mRNA otsene analüüs LC-MS abil on selle suuruse ja heterogeensuse tõttu ebapraktiline. Polü(A) saba uurimiseks tuleb see täispikast mRNA-st lõigata. Levinud meetod hõlmab ensümaatilist lõhustamist RNaasi T1-ga, mis lõikab selektiivselt rG 3'-otsa, säilitades samal ajal polü(A) järjestuse. MRNA proov seeditakse RNaasi T1-ga ja polü(A) lõikusi sisaldavad lõhustamisfragmendid eraldatakse oligo dT-ga kaetud magnethelmeste abil.
Etapp 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Ekstraheeritud sabad analüüsiti LC-MS abil, pakkudes täpset teavet saba pikkuse kohta ühe nukleotiidi eraldusvõimega. Oligonukleotiidide LC-MS analüüsis on eelistatud kromatograafilise režiimina ioonpaaride pöördfaasi (IP-RP) eraldamine liikuva faasi lisanditega, mis on tingitud nende tugevast lahutusvõimest ja ühilduvusest massispektromeetriaga (MS).
Samm 3. Andmete analüüs
Polü(A) saba pikkus ja selle suhteline arvukus sõltuvad piikide arvust ja intensiivsusest, mis on jagatud adenosiini massiga. Massispektri töötlemisel või dekonvolutsioonil eristatakse 100-meerilise polü(A) saba eeldatavat massi (33,163 329 Da kastis) koos masside seeriaga, mille vahekaugus on XNUMX amu, mis on võrdne adenosiini (A) massiga. .
3' polü(A) iseloomustus LC-MS abil
Yaohai-BioPharma on välja töötanud tugeva meetodi mRNA 3' polü(A) iseloomustamiseks, sealhulgas RNaasi T1 lõhustamine ja IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma on välja töötanud tugeva meetodi mRNA 3' polü(A) iseloomustamiseks, sealhulgas RNaasi T1 lõhustamine ja IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
