mRNA 5'-korkimise efektiivsus
mRNA 5'-korkimise efektiivsuse analüüsi tähtsus
MRNA 5'-otsas paiknev korgi struktuur mängib keskset rolli mRNA-de tõhusal translatsioonil, stabiliseerimisel ja transportimisel eukarüootides. In vitro transkribeeritud (IVT) mRNA kontekstis sisestatakse 5'-kork kas ko-transkriptsioonilise katmise või ensümaatilise piiramisprotsessi kaudu. IVT RNA-de asendamatu komponendina on 5′ kork kriitilise kvaliteediatribuudina (CQA), mis nõuab põhjalikku iseloomustamist kogu protsessi arendamise ja partii vabastamise ajal.
Yaohai-Bio Pharma pakub laiaulatuslikke 5' korkimise efektiivsuse analüüsi lahendusi, mis hõlmavad oligonukleotiidlahaste (sondi) disaini, RNaasi H lõhustamist, IP-RP-ioonpaari pöördfaasilist kõrgfektiivset vedelikkromatograafiat (IP-RP-HPLC) / vedelikkromatograafiat. -massispektromeetria (LC-MS), andmete analüüs.
Regulatiivsed nõuded mRNA terviklikkusele
WHO regulatiivsete kaalutluste kohaselt peetakse mRNA struktuuri terviklikkust mRNA vabanemise kriitiliseks kvaliteediatribuudiks. Seega on kontroll vajalik mRNA terviklikkuse, 5′ piiramise efektiivsuse, 3′ polü(A) saba olemasolu või pikkuse ja nii edasi.
Analüütiline meetod
Analüüs |
Meetodid |
mRNA 5'-korkimise efektiivsus |
LC-MS pärast seedimist |
Menetlus
Etapp 1. Oligonukleotiidlahaste (sondi) disain
Lõhustamissond, mis sisaldab 2'-O-metüülnukleotiide ja tetradeoksüribonukleotiide, lõhustab komplementaarse RNA ahela konkreetsetes positsioonides, kui esineb RNaas H. See meetod osutub väga väärtuslikuks suuremate RNA fragmentide sihipäraseks genereerimiseks.
Etapp 2. RNaas H lõhustamine
Biotinüülitud sond, mis on strateegiliselt kavandatud olema komplementaarne mRNA 5'-otsaga, rakendatakse koos RNaasi H-ga, et katalüüsida 5'-otsa oligonukleotiidi, millel on cap-struktuuri, sihipärast lõhustamist.
Etapp 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Oligonukleotiidi LC-MS analüüsis on eelistatud kromatograafiline režiim ioonpaaride pöördfaasi (IP-RP) eraldamine, kasutades liikuva faasi amiini lisandeid. Selle põhjuseks on nende suurepärane lahutusvõime ja ühilduvus massispektromeetriaga (MS).
4. samm. Andmete analüüs
Erinevalt difosfaadi, trifosfaadi või metüleerimata G-korgiga (GpppG) lõhustamisfragmentides täheldatud eristavad massid hõlbustavad nende tuvastamist ja võimaldavad hinnata korkimise tõhusust.
Korkimise efektiivsuse analüüs LC-MS-iga
Yaohai-Bio Pharma on välja töötanud tugevad meetodid mRNA piiramise tõhususe analüüsiks, alates oligonukleotiidide splintide (sondi) disainist, RNaasi H lõhustusest, IP-RP-HPLC/LC-MS-ist kuni andmete analüüsini.
5'-otsa lõhustamisfragmentide ioonkromatogrammid (vasakul) ja elektropihustusmassispektrid (paremal)
EN
