IVT mRNA Voorbereiding

In vitro transkripsie (IVT) is die voorkeurmetode vir die voorbereiding van mRNA, wat in staat is om mikrogram tot milligram mRNA op 'n laboratoriumskaal te lewer. Vir navorsingsdoeleindes het reagensverskaffers veelsydige IVT-reaksiestelsels ontwikkel wat geskik is vir mRNA van matige lengte (1000-4000 nukleotiede).

In hierdie artikel sal ons in vitro-transkripsie (IVT) van mRNA opsom, insluitend die konvensionele IVT-reaksiestelsel wat op 'n laboratoriumskaal gebruik word en die IVT-reaksiestelsel wat geskik is vir ultra-lang mRNA (>9000 nukleotiede).

Kits maak ko-transkripsie-afdekking met CleanCap AG moontlik en verminder immunogenisiteit met m1ψ. DNase I verwyder oorblywende DNA. Lae opbrengs kan wees as gevolg van swak vermenging, reagensoksidasie of DNA-sjabloonkwessies, wat versag kan word deur sentrifugering, vars reagense, kontroles en aanpassing van sjabloonhoeveelheid/reaksietyd.

Yaohai Bio-Pharma verskaf verskeie voorafvervaardigde IVT RNA-produkte (vloeibare/vriesgedroogde poeier) en LNP-afgewerkte produkte, wat proteïene kodeer soos fluoresserende proteïene (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinase Cre en antigeen OVA, om aan verskillende eksperimentele of projek te voldoen. behoeftes.

IVT-stelsel vir ultra-lang mRNA

Konvensionele IVT werk dalk nie vir te lang mRNA (>9000 nt). 'n Diep begrip en rasionele aanpassing van IVT-komponente is nodig.

DNA-sjabloon: Gelineariseerde plasmiede of PCR-produkte met ooreenstemmende promotorvolgordes, opgelos in RNase-vrye H2O. 'n DNA-sjabloonkonsentrasie hoër as 40 nM word aanbeveel vir optimale IVT-toestande.

DTT: Handhaaf ensiemaktiwiteit tydens transkripsie. Vars DTT moet by die reaksiebuffer gevoeg word vir optimale ensiemaktiwiteit.

RNase inhibeerder: Inhibeer RNase-aktiwiteit en handhaaf mRNA-stabiliteit.

T7 RNA polimerase: Kataliseer DNA-transkripsie na RNA, wat ooreenstem met die promotorvolgorde. Die aktiwiteit van T7 RNA-polimerase word deur pH en magnesiumione beïnvloed.

Magnesiumione (Mg2+): 'n Kofaktor vir RNA-polimerase. Te lae konsentrasies verminder transkripsiedoeltreffendheid, terwyl te hoë konsentrasies lei tot RNA-afbraak. Vry [Mg2+] moet aangepas word gebaseer op nukleotiedkonsentrasie. Elke nukleotied chelaat een [Mg2+], dus moet die [Mg2+]-konsentrasie die totale nukleotiedkonsentrasie oorskry.

Nukleosiedtrifosfate (NTP): As substrate is NTP's die basiese eenhede van RNA. NTP-konsentrasies bo 7 mM het 'n positiewe impak op mRNA-produksie.

Spermidien: Stabiliseer DNA-ensiem komplekse en stimuleer transkripsie reaksies; oormatige konsentrasies het egter inhiberende effekte. Die aanbevole spermidienkonsentrasie is tussen 1 en 3 mM.

Anorganiese pirofosfatase (PPase): By IVT-reaksies gevoeg om die ophoping van anorganiese pirofosfaatione (PPi) te voorkom, om hul chelaatvorming met Mg2+ te vermy en voldoende vry Mg2+ te verseker.

Deur gebruik te maak van baanbrekerstegnologie en IVT mRNA-ervaring, bied Yaohai Bio-Pharma 'n eenstop IVT RNA-diens, wat volgordeontwerp, IVT RNA-voorbereiding (met m1ψ-mods), RNA-sirklisering, suiwering, vriesdroog, LNP-inkapseling en kwaliteittoetsing insluit.

Ons is ook aktief op soek na institusionele of individuele globale vennote. Ons bied die mees mededingende vergoeding in die bedryf. As jy enige vrae het, voel asseblief vry om ons te kontak: [email protected]