IVT mRNA Voorbereiding

In vitro transkripsie (IVT) is die voorkeurmetode vir die voorbereiding van mRNA, wat in staat is om mikrogramme tot milligramme mRNA op laboratoriumnivo te lewer. Vir navorsingsdoeleindes het reagensielewerders versatiele IVT-reaksiesisteme ontwikkel wat geskik is vir mRNA van matige lengte (1000-4000 nukleotide).

In hierdie artikel sal ons in vitro transkripsie (IVT) van mRNA opsom, insluitend die konvensionele IVT-reaksiesisteem wat op laboratoriumnivo gebruik word en die IVT-reaksiesisteem wat geskik is vir ultra-lange mRNA (>9000 nukleotide).

Kits maak ko-transkripsionele kapping met CleanCap AG moontlik en verlaag immunogenisiteit met m1ψ. DNase I verwyder residuele DNA. Lae opbrengs kan weens swak menging, reagensieoksidasie of DNA-sjabloonprobleme plaasvind, wat deur sentrifugering, verse reagensies, kontroles en aanpassing van sjabloonkwantiteit/reaksietyd aangepak kan word.

Yaohai Bio-Pharma verskaf verskeie voorafgemaakte IVT RNA-produkte (vloeistof/vriesdroogde poeders) en LNP-eindprodukte, wat proteïene soos fluoreserende proteïene (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinasie Cre en antigen OVA kodereer, om verskillende eksperimentele of projekbehoeftes te voldoen.

IVT-stelsel vir ultra-lange mRNA

Konvensionele IVT mag nie werk vir oor matig lange mRNA (>9000 nt) nie. 'n Diepgaande verstaan en rasionele aanpassing van IVT-komponente is nodig.

DNA-sjabloon: Lineariseerde plasmiede of PCR-produkte met ooreenstemmende promotorvolgorde, opgelos in RNase-vrye H2O. 'n DNA-sjabloonkonsentrasie hoër as 40 nM word voorgestel vir optimale IVT-toestande.

DTT: Behou enzymaktiwiteit tydens transkripsie. Verse DTT moet by die reaksiebuffer gevoeg word vir optimale enzymaktiwiteit.

RNase-inhibitor: Inhibeer RNase-aktiwiteit en behou mRNA-stabiliteit.

T7 RNA-polimerase: Kataliseer DNA-transkripsie in RNA, ooreenstemmend met die promotorvolgorde. Die aktiwiteit van T7 RNA-polimerase word beïnvloed deur pH en magnesiumione.

Magnesiumione (Mg2+): 'n Kofaktor vir RNA-polimerase. Te lae konstellasies verminder transkripsie-effektiwiteit, terwyl te hoë konstellasies lei tot RNA-verval. Vrye [Mg2+] moet aangepas word op grond van nukleotied-konsetrasie. Elke nukleotied bind een [Mg2+], so dat die [Mg2+] konsetrasie die totale nukleotied-konsetrasie moet oorskry.

Nukleosietrifosfaat (NTP): As substraate is NTP's die basiese eenhede van RNA. NTP-konsetrasies bo 7 mM het 'n positiewe invloed op mRNA-produksie.

Spermidien: Stabiliseer DNA-ensiemkomplekse en stimuleer transkripsiereaksies; egter, oormatige konsetrasies het remende effekte. Die aanbevole spermidien-konsetrasie lê tussen 1 en 3 mM.

Anorganiese Pirofosfaat (PPase): Toegevoeg aan IVT-reaksies om die opstapel van anorganiese pirofosfaat ions (PPi) te voorkom, hul chelering met Mg2+ te vermy en voldoende vry Mg2+ te verseker.

Deur pioniers tegnologie en IVT mRNA-ervaring te gebruik, bied Yaohai Bio-Pharma 'n een-stap-IVT RNA-diens aan, wat reeksontwerp, IVT RNA-bereiding (met m1ψ-modifikasies), RNA-siklisering, verfynings, vriesdroging, LNP-inkapseling en kwaliteitstoetsing insluit.

Ons soek ook aktief instansiële of individuele wêreldwye partners. Ons bied die mees mededingende vergoeding in die bedryf. As u enige vrae het, aarzel asb nie om ons te kontak nie: [email protected]