IVT mRNA Hazırlama

In vitro transkriptasyon (IVT), laboratuvar ölçeğinde mikrogramdan miligramlara kadar mRNA üretme yeteneğine sahip olan tercih edilen yöntemdir. Araştırma amaçlı olarak, reaktif sağlayıcıları, orta uzunluktaki mRNA (1000-4000 nükleotid) için uygun esnek IVT reaksiyon sistemleri geliştirmiştir.

Bu makalede, laboratuvar ölçeğinde kullanılan geleneksel IVT reaksiyon sistemi ve ultra-uzun mRNA'lar için (>9000 nükleotid) uygun olan IVT reaksiyon sistemi de dahil olmak üzere mRNA'nın in vitro transkriptasyonunu (IVT) özetleyeceğiz.

Setler, CleanCap AG ile eş zamanlı kaplama imkanı sunar ve m1ψ ile immünijenliği azaltır. DNase I, artan DNA'yı kaldırır. Düşük verim, kötü karıştırma, reaktif oksidasyonu veya DNA şablonu sorunlarından kaynaklanabilir; bunların etkileri merkezî füzyon, taze reaktifler, kontroller ve şablon miktarı/reaksiyon süresi ayarıyla hafifletilebilir.

Yaohai Bio-Pharma, fluoresan proteinlar (eGFP, mCHERRY), lusiferaz, rekombinaz Cre ve antijen OVA gibi proteinleri kodlayan çeşitli ön hazırlı IVT RNA ürünleri (sıvı/dondurulmuş toz) ve LNP bitişik ürünler sunarak, farklı deneysel veya proje gereksinimlerini karşılar.

Ultra-uzun mRNA için IVT Sistemi

Geleneksel IVT, aşırı uzun mRNA'lar (>9000 nt) için işe yaramayabilir. IVT bileşenlerine ilişkin derin bir anlayış ve rasyonel bir ayarlama gerekir.

DNA Şablonu: Karşılık gelen promotor dizileri içeren doğrultularak lineerleşmiş plazmidler veya PCR ürünleri, RNase-free H2O'da çözülmüş. Optimal IVT koşulları için DNA şablonu konsantrasyonunun 40 nM'den yüksek olması önerilir.

DTT: Transkripsiyon sırasında enzim aktivitesini korur. Optimal enzim aktivitesi için reaksiyon tamponuna taze DTT eklenmelidir.

RNase Engelleyici: RNase aktivitesini engeller ve mRNA stabilitesini sağlar.

T7 RNA Polimeraz: Promotor dizisine karşılık gelen DNA'nın RNA'ya transkripsiyonunu kataliz eder. T7 RNA polimerazının aktivitesi pH ve magnezyum iyonları tarafından etkilenir.

Magnezyum Iyonları (Mg2+): RNA polimerazası için bir köfaktör. Çok düşük konsantrasyonlar transkripsiyon verimliliğini azaltırken, çok yüksek konsantrasyonlar RNA bozunmasına neden olur. Serbest [Mg2+] nucleotid konsantrasyonuna göre ayarlanmalıdır. Her nucleotid bir [Mg2+] ile kompleks oluşturur, bu nedenle [Mg2+] konsantrasyonu toplam nucleotid konsantrasyonunu aşmalıdır.

Nükleozit Trifosfatlar (NTP): Substrat olarak NTP'ler RNA'nın temel birimleridir. 7 mM'den yüksek NTP konsantrasyonları mRNA üretimine olumlu bir etkide bulunur.

Spermidin: DNA-enzim komplekslerini stabilize eder ve transkripsiyon reaksiyonlarını uyarır; ancak aşırı konsantrasyonlar inhibitory etkilere sahiptir. Önerilen spermidin konsantrasyonu 1 ile 3 mM arasında değişmektedir.

Inorganik Pirofosfatáz (PPase): Organik pirофосfat iyonlarının (PPi) birikmesini önlemek için IVT reaksiyonlarına eklenir, bunların Mg2+ ile chelasyonunu önler ve yeterli serbest Mg2+ sağlar.

Öncü teknoloji ve IVT mRNA deneyimi kullanılarak, Yaohai Bio-Pharma, dizayn sırasından itibaren IVT RNA hizmeti sunmaktadır: IVT RNA hazırlığı (m1ψ modifikasyonları ile), RNA siklizasyonu, temizleme, donma kurutma, LNP kapsülleme ve kalite testleri içeren tüm süreçleri kaplayan hizmetler sunulmaktadır.

Ayrıca, kurumsal veya bireysel küresel ortaklar arayışındayız. Endüstride en rekabetçi müsadereyi sunuyoruz. Herhangi bir sorunuz varsa, lütfen bizimle iletişime geçmeyi çekinmeyin: [email protected]