IVT mRNA Hazırlığı

İn vitro transkripsiyon (IVT), laboratuvar ölçeğinde mikrogramdan miligrama kadar mRNA üretebilen mRNA hazırlamak için tercih edilen yöntemdir. Araştırma amaçları için, reaktif tedarikçileri orta uzunluktaki (1000-4000 nükleotid) mRNA için uygun çok yönlü IVT reaksiyon sistemleri geliştirmiştir.

Bu makalede, laboratuvar ölçeğinde kullanılan konvansiyonel IVT reaksiyon sistemi ve ultra uzun mRNA (>9000 nükleotid) için uygun IVT reaksiyon sistemi de dahil olmak üzere, mRNA'nın in vitro transkripsiyonu (IVT) özetlenecektir.

Kitler, CleanCap AG ile eş-transkripsiyonel kapatmayı mümkün kılar ve m1ψ ile immünogeniteyi azaltır. DNase I, kalan DNA'yı temizler. Düşük verim, santrifüjleme, taze reaktifler, kontroller ve şablon miktarını/reaksiyon süresini ayarlayarak hafifletilebilen zayıf karıştırma, reaktif oksidasyonu veya DNA şablonu sorunlarından kaynaklanabilir.

Yaohai Bio-Pharma, farklı deneysel veya proje ihtiyaçlarını karşılamak üzere floresan proteinler (eGFP, mCHERRY), lüsiferaz, rekombinasyon Cre ve antijen OVA gibi proteinleri kodlayan çeşitli önceden hazırlanmış IVT RNA ürünleri (sıvı/dondurularak kurutulmuş toz) ve LNP bitmiş ürünleri sağlar.

Ultra uzun mRNA için IVT Sistemi

Konvansiyonel IVT aşırı uzun mRNA (>9000 nt) için işe yaramayabilir. IVT bileşenlerinin derinlemesine anlaşılması ve rasyonel ayarlanması gerekir.

DNA Şablonu: RNase içermeyen H2O'da çözülmüş, karşılık gelen promotör dizilerine sahip doğrusallaştırılmış plazmidler veya PCR ürünleri. Optimal IVT koşulları için 40 nM'den daha yüksek bir DNA şablon konsantrasyonu önerilir.

DTT: Transkripsyon sırasında enzim aktivitesini korur. Optimum enzim aktivitesi için reaksiyon tamponuna taze DTT eklenmelidir.

RNaz İnhibitörü: RNaz aktivitesini inhibe eder ve mRNA stabilitesini korur.

T7 RNA Polimeraz: DNA transkripsiyonunu promotör dizisine karşılık gelen RNA'ya katalizler. T7 RNA polimerazının aktivitesi pH ve magnezyum iyonlarından etkilenir.

Magnezyum İyonları (Mg2+): RNA polimeraz için bir kofaktör. Çok düşük konsantrasyonlar transkripsiyon verimliliğini azaltırken, çok yüksek konsantrasyonlar RNA bozulmasına yol açar. Serbest [Mg2+], nükleotid konsantrasyonuna göre ayarlanmalıdır. Her nükleotid bir [Mg2+]'yi şelatlar, bu nedenle [Mg2+] konsantrasyonu toplam nükleotid konsantrasyonunu aşmalıdır.

Nükleozid Trifosfatlar (NTP): Substrat olarak NTP'ler RNA'nın temel birimleridir. 7 mM'nin üzerindeki NTP konsantrasyonları mRNA üretimi üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir.

Spermidin: DNA-enzim komplekslerini stabilize eder ve transkripsiyon reaksiyonlarını uyarır; ancak aşırı konsantrasyonların inhibitör etkileri vardır. Önerilen spermidin konsantrasyonu 1 ile 3 mM arasındadır.

İnorganik Pirofosfataz (PPase): İnorganik pirofosfat iyonlarının (PPi) birikimini önlemek, bunların Mg2+ ile şelasyonunu önlemek ve yeterli serbest Mg2+ sağlamak için IVT reaksiyonlarına eklenir.

Öncü teknoloji ve IVT mRNA deneyiminden yararlanan Yaohai Bio-Pharma, dizi tasarımı, IVT RNA hazırlığı (m1ψ modlarıyla), RNA siklizasyonu, saflaştırma, dondurarak kurutma, LNP kapsülleme ve kalite testini kapsayan tek noktadan IVT RNA hizmeti sunmaktadır.

Ayrıca aktif olarak kurumsal veya bireysel küresel ortaklar arıyoruz. Sektördeki en rekabetçi tazminatı sunuyoruz. Herhangi bir sorunuz varsa lütfen bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin: [email protected]