Fed-batch Fermentasyon Stratejisinin Gücünü Kullanma

Pichia pastoris, çeşitli heterolojik proteinlerin üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır. Fed-Batch beslemesi yoluyla uygulanan Yüksek Hücre Yoğunluğu Fermentasyonu (HCDF) teknolojisi, biyofarmasötikler ve endüstriyel enzimlerin büyük ölçekli üretimini başarıyla gerçekleştirmiştir. Kesinlikle kontrol edilen ortamlarda, HCDF teknolojisinin kullanımı yüksek verimli, yüksek etkinliğe sahip ve maliyet etkili rekombinant proteinler elde etmeyi sağlar.

Son araştırmalar, HCDF stratejileri aracılığıyla Pichia pastoris'te heterolojik proteinlerin üretimini ve aktivitesini artırmaya yönelik çabaların devam ettiğini göstermektedir. HCDF teknolojisi, tanımlı ortamlarda yüksek seviyede hücre kümesine kolayca ulaşılmasını sağlayarak, artırılmış aktiviteye sahip ve maliyet açısından daha uygun rekombinant proteinlerin elde edilmesini mümkün kılar. Ancak, Pichia pastoris'te belirli proteinlerin yüksek seviyede ifadesini optimize etmek için uygun HCDF stratejisi seçmek hâlâ bir zorluk olarak kalır.

Yüksek Hücre Yoğunluğu Fermentasyonu (HCDF)

Pichia pastoris heterolog protein üretiminde öne çıkmaktadır ve otomatik biyoreaktörlerde HCDF için tercih edilir. HCDF 3 aşamadan oluşur: gliserol toplu işlem, besleme ve metanol tetiklemesi. Yaohai Bio-Pharma mikrobiyal fermantasyon alanında on yıldan fazla deneyime sahip olup 400'den fazla proje için hizmet vermiştir. Şirket, çeşitli HCDF stratejilerini kullanarak protein üretim verimliliğini artırmak için kapsamlı uzmanlık ve iyi geliştirilmiş teknolojiye sahiptir.

Metanol, hem AOX1'yi tetikleyici olarak hem de karbon kaynağı olarak işlev görür, ancak toksiklikten kaçınmak için konsantrasyonu kontrol edilmelidir. Pichia pastoris'nin büyümesi ve protein ifadesini optimize etmek için farklı metanol besleme stratejilerini değerlendirmek önemlidir.

Metanol tetikleme stratejisi

Fed-batch HCDF metanol induksiyon stratejisi içinde, durum-tabanlı induksiyon stratejileri, çevrimiçi/çevrimdışı veya ileri/geri kontrol aracılığıyla metanolun eklenmesini düzenleyen bir dizi kontrol yöntemini içerir. İstatistiksel induksiyon stratejileri arasında en önemlileri μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, metanol-stat ve biomass-stat'tır.

1.1 μ-stat

μ-stat stratejisi, μ'yu kontrol ederek biyoması sabit tutar, tekrarlanabilirliği destekler ve μ'nün protein ifadesi üzerindeki etkisini inceler. Ancak, doğrudan metanol ve DO kontrolüne sahip olmaması nedeniyle, birikim ve ROS üretimine yol açma riski taşır.

1.2 DO-stat

DO-stat stratejisi, oksijenlenmeyi korumak için çözünmüş oksijeni kontrol ederek metanol beslemesini dolaylı olarak düzenler, ancak metanol konsantrasyonunu ve büyüme oranını sabit tutmaz ki bu protein ifadesinin incelenmesini etkileyebilir. Oksijenlenme, aerobik fermantasyonda bir zorluk teşkil eder ve saf oksijen eklemesi pahalı ve toksik olabilirken, basınç artırılması daha ekonomik bir yaklaşımdır ve aynı zamanda protein aktivitesini de artıracaktır.

1.3 Methanol-stat

Metanol konsantrasyonunun yetersiz kontrollü, hem μ-stat hem de DO-stat stratejilerine sınırlamalar getirir. Aç/kapa modunda çalışan metanol istatistiksel stratejiler salınımlara karşı duyarlıdır ve hassasiyet eksikliktedir. Buna karşılık, PID denetleyicileri metanol konsantrasyonunu daha hassas bir şekilde düzenler ve fermantasyon etkinliğini artırır.

1.4 Biomass-stat

Biyokütle-stat stratejisi, biyokütlenin metanol besleme ile olan ilişkisini tanımlar ve protein verimini artırmak için metanol besleme oranını optimize eder. Biyokütlenin çevrimiçi izlenmesi daha uygulanabilir olup, akış sitometrisi tercih edilen yöntemdir. 1000L ölçeğinde, metanol besleme oranının optimize edilmesi, kavanoz fermantasyonundan daha iyi sonuçlar alarak, enzim aktivitesini, verimi ve üretkenliği önemli ölçüde artırır.

Ortak besleme stratejisi

Glicerol, AOX1 promotorünün inhibitörü olarak, metanol endüksiyonu öncesinde tamamen tüketilmelidir; yoksa protein üretimini baskılayabilir. Ortak substratlar enzim aktivitesini artırabilir, ancak fazla miktarda glicerol büyüme ve ifadeye zarar verebilir. Sorbitol, askorbik asit, mannytol ve diğerleri, glicerolün yerine geçebilir, proteolizi azaltır, yetiştirme süresini kısaltır ve protein ifadesini artırır.

Kültür bankası, kültür özelliklerinin kararlılığını korumak için uygun muhafaza yöntemlerinin benimsenmesi ve uygun bir ortamda yerleştirilmesi gerektiği anlamına gelir. Yaohai Bio-Pharma, glicerol stok muhafazasının (ultra-düşük sıcaklık dondurucuları veya sıvı azot yoluyla) ve maya ve E. coli'nin donma-kurutma muhafazasının gereksinimlerini karşılayabilir.

Kısıtlama ile ilgili strateji

Pichia pastoris'te, düşük DO, metanol konsantrasyonu ve oksijen sınırı gibi kısıtlayıcı koşullar rekombinant protein ifadesini artırır. Oksijensiz koşullar, metanol birikimi yoluyla AOX1 promotorunu aktive eder, bu da protein çıkışıyı artırırken üretilen ısıyı azaltır. Düşük sıcakta indirgeme, verimi, aktiviteyi, kararlılığı ve hücre hayatiyetini artırır ancak soğutma maliyetlerini artırır. pH ve nitrojen sınırlandırması da ifadeye yardımcı olur, ancak operasyonel sorunlara neden olmamak için dikkatli uygulanmalıdır. Nitrojen sınırlandırması, belirli protein üretkenliğini önemli ölçüde artırır.

Yaohai Bio-Pharma aynı zamanda kurumsal veya bireysel küresel ortaklar arayışındadır ve endüstryede en rekabetçi ödülleri sunmaktadır. Herhangi bir sorunuz varsa, lütfen bizimle iletişime geçmeyi çekinmeyin: [email protected]