Beslemeli-parti Fermantasyon Stratejisinin Gücünden Yararlanma

Pichia pastoris, çeşitli heterolog proteinlerin üretiminde yaygın olarak kullanılır. Fed-Batch besleme yoluyla uygulanan Yüksek Hücre Yoğunluğu Fermentasyonu (HCDF) teknolojisi, biyofarmasötiklerin ve endüstriyel enzimlerin büyük ölçekli üretimini başarıyla gerçekleştirmiştir. Hassas bir şekilde kontrol edilen ortamlarda, HCDF teknolojisinin kullanımı yüksek verimli, yüksek aktiviteli ve uygun maliyetli rekombinant proteinler elde edebilir.

Son araştırmalar, HCDF stratejileri aracılığıyla Pichia pastoris'te heterolog proteinlerin üretimi ve aktivitesini artırmak için çaba sarf edildiğini göstermektedir. HCDF teknolojisi, tanımlanmış ortamlarda yüksek seviyeli hücre kümelerinin zahmetsizce elde edilmesini sağlar ve böylece HCDF aracılığıyla artırılmış aktiviteye ve azaltılmış maliyetlere sahip bol miktarda rekombinant proteinin edinilmesini mümkün kılar. Ancak, Pichia pastoris'te belirli proteinlerin yüksek seviyeli ifadesini optimize etmek için uygun HCDF stratejisini seçmek bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Yüksek Hücre Yoğunluklu Fermantasyon (HCDF)

Pichia pastoris, otomatik biyoreaktörlerde HCDF için tercih edilen heterolog protein üretiminde üstündür. HCDF'nin 3 aşaması vardır: gliserol partisi, besleme ve metanol indüksiyonu. Yaohai Bio-Pharma, mikrobiyal fermantasyonda on yılı aşkın deneyime sahiptir ve 400'den fazla projeye hizmet vermiştir. Şirket, protein üretiminin verimliliğini artırmak için çeşitli HCDF stratejilerini kullanmasını sağlayan kapsamlı uzmanlığa ve iyi gelişmiş teknolojiye sahiptir.

Metanol hem AOX1 indükleyicisi hem de karbon kaynağı olarak hizmet eder, ancak toksisiteyi önlemek için konsantrasyonu kontrol edilmelidir. Pichia pastoris'in büyümesini ve protein ifadesini optimize etmek için farklı metanol besleme stratejilerini değerlendirmek çok önemlidir

Metanol indüksiyon stratejisi

Beslemeli-parti HCDF metanol indüksiyon stratejisinde, durum tabanlı indüksiyon stratejileri, çevrimiçi/çevrimdışı veya ileri/geri kontrol yoluyla metanolün ek eklenmesini düzenleyen bir dizi kontrol metodolojisini kapsar. İstatistiksel indüksiyon stratejileri arasında başlıcaları μ-stat, Çözünmüş Oksijen (DO)-stat, metanol-stat ve biyokütle-stat'tır.

1.1 μ-stat

μ-stat stratejisi, μ'yi kontrol ederek, tekrarlanabilirliğe yardımcı olarak ve μ'nin protein ekspresyonu üzerindeki etkisini inceleyerek biyokütleyi sabit tutar. Ancak, doğrudan metanol ve DO kontrolünden yoksundur ve bu da birikim ve ROS oluşumu riskini doğurur.

1.2 DO-stat

DO-stat stratejisi, oksijenasyonu korumak için çözünmüş oksijeni kontrol ederek metanol beslemesini dolaylı olarak düzenler, ancak metanol konsantrasyonunu ve büyüme hızını düzeltmez, bu da protein ekspresyonunun incelenmesini etkileyebilir. Oksijenasyon, aerobik fermantasyonda bir zorluk oluşturur ve saf oksijen takviyesi maliyetli ve toksik olabilse de, basınç geliştirme, protein aktivitesini de artırabilen daha ekonomik bir yaklaşımdır.

1.3 Metanol-stat

Metanol konsantrasyonunun yetersiz kontrolü, hem μ-stat hem de DO-stat stratejileri için sınırlamalar oluşturur. Açık/kapalı modunda çalışan metanol istatistiksel stratejileri dalgalanmalara eğilimlidir ve hassasiyetten yoksundur. Buna karşılık, PID denetleyicileri metanol konsantrasyonunun daha hassas bir şekilde düzenlenmesini sağlayarak genel fermantasyon etkinliğini artırır.

1.4 Biyokütle-istatistik

Biyokütle-stat stratejisi, biyokütle ve metanol besleme arasındaki ilişkiyi tanımlar ve protein verimini artırmak için metanol besleme oranını optimize eder. Biyokütlenin çevrimiçi izlenmesi daha pratiktir ve tercih edilen yöntem akış sitometrisidir. 1000L ölçeğinde, metanol besleme oranını optimize etmek enzim aktivitesini, verimi ve üretkenliği önemli ölçüde iyileştirerek şişe fermantasyonundan daha iyi performans gösterir.

Ortak beslenme stratejisi

Gliserol, bir AOX1 promotör inhibitörü olarak, protein üretimini baskılamaktan kaçınmak için metanol indüksiyonundan önce tamamen tüketilmelidir. Eş-substratlar enzim aktivitesini artırabilir ancak aşırı gliserol büyümeye ve ifadeye zarar verebilir. Sorbitol, askorbik asit, mannitol ve diğerleri gliserolün yerini alabilir, proteolizi ve yetiştirme süresini azaltabilir ve protein ifadesini artırabilir.

Suş bankası, suş özelliklerinin stabilitesini korumak için uygun koruma yöntemlerinin benimsenmesini ve uygun bir ortama yerleştirilmesini gerektirir. Yaohai Bio-Pharma, gliserol stokunun korunması (ultra düşük sıcaklıklı dondurucular veya sıvı nitrojen yoluyla) ve maya ve E. coli'nin dondurularak kurutularak korunması gereksinimlerini karşılayabilir.

Kısıtlama kaynaklı strateji

Pichia pastoris'te düşük DO, metanol konsantrasyonu ve oksijen sınırı gibi kısıtlayıcı koşullar rekombinant protein ekspresyonunu artırır. Oksijenle sınırlı koşullar metanol birikimi yoluyla AOX1 promotörünü aktive ederek ısıyı azaltırken protein çıktısını artırır. Düşük sıcaklık indüksiyonu verimi, aktiviteyi, kararlılığı ve hücre canlılığını artırır ancak soğutma maliyetleri ekler. pH ve azot sınırlaması da ekspresyonu destekler ve operasyonel sorunlardan kaçınmak için dikkat gerektirir. Azot sınırlaması özellikle spesifik protein üretkenliğini artırır.

Yaohai Bio-Pharma ayrıca aktif olarak kurumsal veya bireysel küresel ortaklar arıyor ve sektördeki en rekabetçi tazminatı sunuyor. Herhangi bir sorunuz varsa lütfen bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin: [email protected]