Inovatívne techniky sestavovania pre veľkomerové syntézu génu

Technológia súťažového sestavovania veľkých DNA fragmentov od nuly je kameňom základným syntézy génu, ktorá zahŕňa metódy ako BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibsonovo sestavenie, CPEC a Overlap PCR. V dôsledku obmedzení súčasnej technológie v presnej syntéze DNA o dĺžke genu jednou fázou je potrebné kombinovať in vitro a in vivo techniky sestavovania na sestavenie oligonukleotidových fragmentov syntetizovaných v úsecích do dlhých DNA fragmentov.

In vitro techniky sestavovania

Bývajú rozčlenené do rôznych metód na základe veľkosti fragmentu a charakteristik sekvencie, pričom spoločnou požiadavkou je použitie nástrojových enzymov. Overlap PCR, ktorá sa zakladá na metóde DNA polymerázy, je jednoduchá a rýchla v operácii. Metódy BioBrick a BglBrick, ktoré sa spoliehajú na isoschizomery, umožňujú štandardizovanú montáž, hoci metóda BioBrick nie je vhodná pre fúziové proteíny. Metóda Golden Gate klonovania, ktorá sa zakladá na typ IIS obmedzovacích enzymoch, umožňuje efektívne seemless ligáciu viacerých fragmentov. Metóda Gibsonovej montáže, ktorá využíva kombináciu viacerých nástrojových enzymov, umožňuje seemless ligáciu s veľkosťami fragmentov dosahujúcich niekoľko stoviek kb. Štandardizovaný dizajn DNA komponentov zvyšuje využitok existujúcich fragmentov.

Techniky in vivo montáže

Aj keď in vitro montované fragmenty môžu mať veľkosť niekoľko stoviek kb, často však nie je výnos dostatočný, čo vyžaduje amplifikáciu pomocou organizmov ako Escherichia coli. Pri sústavnom zoskladení úlomkov dlhšich ako 20 kb sa často používajú rekombinantné systémy v organizmom, vrátane Bacillus subtilis, kvasnic a inženiersky upravených baktérií. Kvasnice, ako bežne používaný hostiteľ, sa uznávajú už po mnoho rokov za ich efektívnu schopnosť homologického rekombinovania. Môžu sa používať na zoskladanie umelých chromozómov dosahujúcich dĺžku niekoľko megabáz (Mb). Okrem toho vykazuje Saccharomyces cerevisiae neobyčajnú toleranciu pre dĺžku chromozómu, čo poskytuje teoretické základy pre využitie kvasíc na zostavovanie ultra-dlhkých chromozómov u vyšších organizmov.

Aplikácie

Yaohai Bio-Pharma primárne používa dve metódy montáže pre syntézu génu: ligaznú montáž a montáž DNA polymerázy. Metóda ligaznej montáže pripája prekrytové a hybridizované 5'-fosforylovane oligonukleotidové fragmenty do dvojvlákňovej DNA pomocou DNA ligazy. Metóda polymeráznej montáže využíva DNA polymerázu na rozšírenie prekrytých oligonukleotidových fragmentov prostredníctvom hybridizácie, získavajúc myšlienku rôznych dĺžok, a nakoniec amplifikuje úspešne montované plné fragmenty pomocou primerov. Yaohai môže pomôcť klientom splniť špecifické požiadavky v súvislosti so syntézou génu.

Hľadáme tiež aktívne globálnych partnerov, či už institucionálnych alebo jednotlivcov. Ponúkame najkonkurenceschopnejšie odškodnenie v odvetví. Ak máte akékoľvek otázky, neváhejte nás kontaktovať: [email protected]