Využitie síly fermentačnej stratégie Fed-batch

Pichia pastoris sa široko používa v produkcií rôznych heterologických bílkovín. Technológia fermentácie vo vysokoj hustote buniek (HCDF), implementovaná cez Fed-Batch krmenie, úspešne dosiahla veľkomerovú výrobu biolfarmaceutík a priemyselných enzymov. V presne kontrolovanom prostredí môže využitie technológie HCDF získať vysokoproduktívne, vysokoaktívne a ekonomické rekombinantné bílkoviny.

Nedávne výskumy ukazujú, že prostredníctvom stratégií HCDF sa snažia zvýšiť produkciu a aktivitu heterologických bílkovín v Pichia pastoris. Technológia HCDF umožňuje jednoducho dosiahnuť vysoké hromadné bunky v definovanom prostredí, čo umožňuje získať bohaté rekombinantné bílkoviny s vyššou aktivitou a sníženými nákladmi prostredníctvom HCDF. Avšak výber vhodnej stratégie HCDF na optimalizáciu vysokého výrazu špecifických bílkovín v Pichia pastoris stále zostáva výzvou.

Fermentácia vo vysokoj hustote buniek (HCDF)

Pichia pastoris vyniká v produkci heterologických bílkovín, obzvlášť upřednostňovaná pro HCDF v automatizovaných bioreaktoroch. HCDF má 3 fáze: dávkovanie glycerolu, krmenie a indukcia methanolom. Yaohai Bio-Pharma sa pyšní viac ako desaťročím skúsenosťami v mikrobiálnom fermentovaní a poskytla služby pre viac ako 400 projektov. Spoločnosť disponuje rozsiahlymi expertizou a dobre vyvinutou technológiou, ktorá jej umožňuje používať rôzne strategie HCDF na zlepšenie účinnosti produkcie bílkovín.

Methanol slúži ako induktor AOX1 aj ako uhlíkový zdroj, avšak jeho koncentrácia musí byť riadená, aby sa predišlo toxickému pôsobeniu. Hodnotenie rôznych stratégií krmenia methanolom je kľúčové pre optimalizáciu rastu Pichia pastoris a expresie bílkovín.

Stratégia indukcie methanolom

V stratégii indukcie methanolom v systéme fed-batch HCDF sú stavové stratégie indukcie zoskupením riadených metód, ktoré regulujú doplnkové pridávanie methanolu cez online/offline alebo predná/poza riadenie. Medzi štatistickými indukčnými stratégiami patria hlavne μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, methanol-stat a biomass-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat stratégia udržiava biomasu stabilnou kontrolovaním μ, čo pomáha reproductibilite a študiu vplyvu μ na expresiu bílkovín. Avšak, chýba jej priame riadenie methanolu a DO, čo niesie riziko akumulácie a generovania ROS.

1.2 DO-stat

Stratégia DO-stat nepriamo reguluje prídavok metanolu kontrolovaním disolved oxygen (DO) na úrovni, aby sa zabezpečila kyslíkovácie, ale nespôsobuje to fixáciu koncentrácie methanolu a rastovej rýchlosti, čo môže ovplyvniť štúdiu expresie bielek. Kyslíkovanie predstavuje výzvu pri aeróbnej fermentácii, pričom doplnenie čistého kyslíka môže byť drahé a toxické, zatiaľ čo posilnenie tlaku je ekonomičnejším prístupom, ktorý môže tiež zlepšiť aktivitu bielek.

1.3 Methanol-stat

Nedostatočná kontrola koncentrácie methanolu predstavuje obmedzenia pre oboje strategie μ-stat a DO-stat. Statistické stratégie methanolu, ktoré fungujú v režime on/off, súáchliave k fluktuáciám a chýbajú presnosti. Na odkáze, PID regulačné systémy ponúkajú presnejšiu reguláciu koncentrácie methanolu, čo zvyšuje celkovú účinnosť fermentácie.

1.4 Biomasa-stat

Stratégia biomass-stat definuje vzťah medzi biomasa a kŕmením metanolom, optimalizujúc rýchlosť kŕmenia metanolom na zvýšenie výnosu bielek. Online monitorovanie biomasy je praktickejšie, pričom metóda flow cytometry je preferovaná. V mierke 1000L významne zlepšuje optimalizácia rýchlosti kŕmenia metanolom činnosť enzymov, výnos a produktivitu, prekonávajúc fermovačnú fermentáciu.

Ko-kŕmovacia stratégi

Glycerol ako inhibičná látka AOX1 musí byť úplne spotrebovaný pred indukciou metanolom, aby sa vyhovie potlačovaniu produkcie bielek. Spoločné substráty môžu zvyšovať činnosť enzymov, ale nadbytok glycerolu môže škodiť rastu a expresii. Sorbitol, askorbová kyselina, manitol a iné môžu nahradiť glycerol, čo zníži proteolýzu a čas kultivácie a zvýši expresiu bielek.

Banka štôpov vyžaduje použitie príslušných metód konzervácie a umiestnenie do vhodného prostredia na udržanie stability charakteristik štôpov. Yaohai Bio-Pharma môže spĺňať požiadavky na konzerváciu glycerolových štôpov (cez úložnice s úplne nízkou teplotou alebo kapalným dusíkom) a konzerváciu kvasinky a E. coli metódou zmrznutého sušenia.

Stratégia indukovaná obmedzeniami

V Pichia pastoris podporujú obmedzujúce podmienky, ako je nízka DO, koncentrácia metanolu a obmedzenie kyslíka výrobu rekombinantných bielkovín. Podmienky obmedzenia kyslíka aktivujú promočer AOX1 cez akumuláciu metanolu, čo zvyšuje výstup bielkovín a zníži teplo. Indukcia pri nízkej teplote zvyšuje výnos, aktivity, stabilitu a životoschopnosť buniek, no pridá aj náklady na chladenie. Obmedzenie pH a dúsiku tiež podporuje expresiu, pričom treba dbať na to, aby sa vyhli operatívne problémy. Obmedzenie dúsiku znamenite zvyšuje špecifickú produkčnosť bielkovín.

Yaohai Bio-Pharma aktivne hľadá globálnych partnerov, ktorí sú inštitúciami alebo jednotlivcami, a ponúka najkonkurenceschopnejšie odmeny v odvetví. Ak máte akékoľvek otázky, neváhajte nás kontaktovať: [email protected]