Využitie sily stratégie Fed-batch fermentácie

Pichia pastoris sa široko používa pri výrobe rôznych heterológnych proteínov. Technológia fermentácie s vysokou hustotou buniek (HCDF), implementovaná prostredníctvom dávkového dávkovania Fed, úspešne dosiahla rozsiahlu výrobu biofarmaceutík a priemyselných enzýmov. V presne kontrolovanom médiu môže využitie technológie HCDF získať vysoko výťažné, vysoko aktívne a cenovo výhodné rekombinantné proteíny.

Nedávny výskum naznačuje, že prostredníctvom stratégií HCDF sa vynakladá úsilie na zvýšenie produkcie a aktivity heterológnych proteínov v Pichia pastoris. Technológia HCDF umožňuje bez námahy dosiahnuť vysokoúrovňové bunkové zhluky v definovaných médiách, čím umožňuje získanie hojných rekombinantných proteínov so zvýšenou aktivitou a zníženými nákladmi prostredníctvom HCDF. Výber vhodnej stratégie HCDF na optimalizáciu vysokej úrovne expresie špecifických proteínov v Pichia pastoris však zostáva výzvou.

Fermentácia s vysokou bunkovou hustotou (HCDF)

Pichia pastoris vyniká v produkcii heterológnych proteínov, uprednostňovaných pre HCDF v automatizovaných bioreaktoroch. HCDF má 3 stupne: dávkovanie glycerolu, podávanie a indukciu metanolom. Yaohai Bio-Pharma sa môže pochváliť viac ako desaťročnými skúsenosťami v oblasti mikrobiálnej fermentácie a obslúžila viac ako 400 projektov. Spoločnosť má rozsiahle odborné znalosti a dobre vyvinutú technológiu, ktorá jej umožňuje využívať rôzne stratégie HCDF na zlepšenie účinnosti produkcie bielkovín.

Metanol slúži ako induktor AOX1 aj ako zdroj uhlíka, ale jeho koncentrácia musí byť kontrolovaná, aby sa zabránilo toxicite. Vyhodnotenie rôznych stratégií kŕmenia metanolom je kľúčové pre optimalizáciu rastu Pichia pastoris a expresie proteínov

Stratégia indukcie metanolu

V stratégii indukcie metanolu HCDF s dávkovaním obsahujú štátne indukčné stratégie súbor kontrolných metodológií, ktoré regulujú doplnkové pridávanie metanolu prostredníctvom online/offline alebo priamej/reverznej kontroly. Medzi štatistické indukčné stratégie patria medzi hlavné μ-stat, rozpustený kyslík (DO)-stat, metanol-stat a biomass-stat.

1.1 μ-stat

Stratégia μ-stat udržuje biomasu stabilnú kontrolou μ, napomáhaním reprodukovateľnosti a štúdiom účinku μ na expresiu proteínov. Chýba mu však priama kontrola metanolu a DO, čo riskuje akumuláciu a tvorbu ROS.

1.2 DO-stat

Stratégia DO-stat nepriamo reguluje prívod metanolu riadením rozpusteného kyslíka na udržanie okysličovania, ale nefixuje koncentráciu metanolu a rýchlosť rastu, čo môže ovplyvniť štúdium expresie proteínu. Okysličovanie predstavuje výzvu pri aeróbnej fermentácii a zatiaľ čo suplementácia čistého kyslíka môže byť nákladná a toxická, zvýšenie tlaku je ekonomickejší prístup, ktorý môže tiež zvýšiť aktivitu proteínov.

1.3 Metanol-stat

Nedostatočná kontrola koncentrácie metanolu predstavuje obmedzenia pre stratégie μ-stat aj DO-stat. Štatistické stratégie metanolu, ktoré fungujú v režime zapnutia/vypnutia, sú náchylné na výkyvy a chýbajú im presnosť. Na rozdiel od toho PID regulátory ponúkajú presnejšiu reguláciu koncentrácie metanolu, čím sa zvyšuje celková účinnosť fermentácie.

1.4 Biomasa-stat

Stratégia biomasy-stat definuje vzťah medzi biomasou a dodávaním metanolu, pričom optimalizuje rýchlosť pridávania metanolu na zvýšenie výnosu bielkovín. Online monitorovanie biomasy je praktickejšie, pričom preferovanou metódou je prietoková cytometria. V 1000 l mierke optimalizácia rýchlosti dávkovania metanolu výrazne zlepšuje aktivitu enzýmu, výťažok a produktivitu, čím prekonáva fermentáciu v bankách.

Stratégia spoločného kŕmenia

Glycerol ako inhibítor promótora AOX1 sa musí úplne spotrebovať pred indukciou metanolu, aby sa zabránilo potlačeniu produkcie proteínov. Kosubstráty môžu zvýšiť aktivitu enzýmu, ale nadbytok glycerolu môže poškodiť rast a expresiu. Sorbitol, kyselina askorbová, manitol a iné môžu nahradiť glycerol, znížiť proteolýzu a kultivačný čas a zvýšiť expresiu proteínov.

Banka kmeňov si vyžaduje prijatie vhodných metód uchovávania a umiestnenie do vhodného prostredia, aby sa zachovala stabilita charakteristík kmeňa. Yaohai Bio-Pharma môže splniť požiadavky na konzerváciu glycerolových zásob (prostredníctvom mrazničiek s ultranízkou teplotou alebo tekutým dusíkom) a konzerváciu kvasiniek a E. coli sušením mrazom.

Stratégia vyvolaná obmedzeniami

V Pichia pastoris reštriktívne podmienky, ako je nízka DO, koncentrácia metanolu a limit kyslíka, zvyšujú expresiu rekombinantného proteínu. Podmienky obmedzené na kyslík aktivujú promótor AOX1 prostredníctvom akumulácie metanolu, čím sa zvyšuje produkcia bielkovín a zároveň sa znižuje teplo. Nízkoteplotná indukcia zvyšuje výťažok, aktivitu, stabilitu a životaschopnosť buniek, ale zvyšuje náklady na chladenie. Obmedzenie pH a dusíka tiež napomáha vyjadreniu, čo si vyžaduje opatrnosť, aby sa predišlo prevádzkovým problémom. Obmedzenie dusíka výrazne zvyšuje produktivitu špecifických proteínov.

Yaohai Bio-Pharma tiež aktívne hľadá inštitucionálnych alebo individuálnych globálnych partnerov a ponúka najkonkurencieschopnejšiu kompenzáciu v tomto odvetví. Ak máte akékoľvek otázky, neváhajte nás kontaktovať: [email protected]