Processo de fabricação de mRNA eGFP

A produção de mRNA eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) envolve uma série de técnicas de biologia molecular para gerar uma molécula de RNA funcional que codifica a expressão do eGFP. Na área de mRNA eGFP, a Yaohai Bio-Pharma acumulou ampla experiência em atender às necessidades específicas dos clientes. Aproveitando nossa experiência, sintetizamos o fluxo do processo para produzir mRNA EGFP.

1. Clonagem do gene eGFP: É para obter a sequência genética que codifica para eGFP. Este gene é tipicamente clonado de um vetor plasmídeo preexistente ou sintetizado artificialmente com base na sequência de nucleotídeos conhecida. O gene clonado é então verificado por meio de sequenciamento para garantir a precisão.
2. Otimização genética para expressão: Para expressão ótima no sistema alvo (por exemplo, células de mamíferos, bactérias ou sistemas de transcrição in vitro), o gene eGFP pode passar por otimização de códons. Isso envolve substituir códons raros na sequência original por outros mais frequentemente usados ​​no organismo hospedeiro, aumentando as chances de tradução eficiente.
3. In vitro Preparação do modelo de transcrição: Uma vez que o gene otimizado esteja pronto, ele é incorporado em um vetor adequado, frequentemente um plasmídeo, que contém elementos reguladores necessários para a transcrição (por exemplo, uma sequência promotora). Este plasmídeo serve como um molde para transcrição in vitro.
4. In vitro Transcrição: Usando o molde de plasmídeo preparado, a transcrição in vitro é realizada para sintetizar o mRNA eGFP. Este processo envolve o uso de enzimas RNA polimerase, que reconhecem a sequência promotora e iniciam a transcrição, produzindo uma fita de RNA complementar ao molde de DNA. Dependendo da aplicação desejada, o mRNA pode ser encapsulado, poliadenilado e/ou modificado para aumentar a estabilidade e a eficiência da tradução.
5. Purificação e Controle de Qualidade: O mRNA eGFP sintetizado é então purificado para remover quaisquer contaminantes, incluindo DNA, proteínas e nucleotídeos livres. Os métodos de purificação podem incluir eletroforese em gel, cromatografia em coluna ou separação baseada em esferas. Após a purificação, o mRNA é analisado quanto à qualidade, incluindo concentração, pureza e integridade, usando técnicas como espectrofotometria UV-Vis e eletroforese em gel.
6. Armazenamento e Entrega: O mRNA eGFP purificado é normalmente armazenado em baixas temperaturas para manter a estabilidade. Para uso experimental, o mRNA pode ser entregue em células usando vários métodos, incluindo eletroporação, lipofecção ou vetores virais, dependendo da aplicação específica e do tipo de célula alvo.
7. Expressão e Verificação: Uma vez dentro da célula, o mRNA eGFP é traduzido na proteína fluorescente verde aprimorada, que pode ser visualizada usando microscopia de fluorescência. Isso permite a verificação da produção, entrega e expressão bem-sucedidas do mRNA.

Em resumo, a produção de mRNA eGFP envolve a clonagem do gene, sua otimização para expressão, a preparação de um modelo de transcrição in vitro, a realização da reação de transcrição, a purificação do mRNA resultante e, finalmente, sua entrega nas células para expressão e verificação.

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