Processo de Fabricação do mRNA de eGFP

A produção de mRNA de eGFP (Proteína de Fluorescência Verde Aumentada) envolve uma série de técnicas de biologia molecular para gerar uma molécula de RNA funcional que codifica para a expressão do eGFP. Na área de mRNA de eGFP, a Yaohai Bio-Pharma acumulou ampla experiência em atender às necessidades específicas dos clientes. Com base em nossa experiência, sintetizamos o fluxo de processo para produzir mRNA de EGFP.

1. Clonagem do Gene eGFP : Obter a sequência do gene que codifica para o eGFP. Esse gene geralmente é clonado de um vetor plasmídico pré-existente ou sintetizado artificialmente com base na sequência de nucleotídeos conhecida. O gene clonado é então verificado por meio de sequenciamento para garantir precisão.
2. Otimização do Gene para Expressão : Para expressão ótima no sistema alvo (por exemplo, células mamíferas, bactérias ou sistemas de transcrição in vitro), o gene eGFP pode passar por otimização de codons. Isso envolve a substituição de codons raros na sequência original por codons mais frequentemente usados no organismo hospedeiro, aumentando as chances de tradução eficiente.
3. In vitro Preparação do Modelo de Transcrição : Uma vez que o gene otimizado está pronto, ele é incorporado em um vetor adequado, muitas vezes um plasmídeo, que contém elementos regulatórios necessários para a transcrição (por exemplo, uma sequência promotora). Este plasmídeo serve como modelo para transcrição in vitro.
4. In vitro Transcrição : Usando o plasmídeo preparado como modelo, a transcrição in vitro é realizada para sintetizar mRNA de eGFP. Este processo envolve o uso de enzimas polimerases de RNA, que reconhecem a sequência promotor e iniciam a transcrição, produzindo uma fita de RNA complementar ao DNA modelo. Dependendo da aplicação desejada, o mRNA pode ser chapéuado, poliadenilado e/ou modificado para aumentar a estabilidade e a eficiência de tradução.
5. Purificação e Controle de Qualidade : O mRNA de eGFP sintetizado é então purificado para remover qualquer contaminante, incluindo DNA, proteínas e nucleotídeos livres. Métodos de purificação podem incluir eletroforese em gel, cromatografia em coluna ou separação baseada em partículas magnéticas. Após a purificação, o mRNA é analisado quanto à qualidade, incluindo concentração, pureza e integridade, utilizando técnicas como espectrofotometria UV-Vis e eletroforese em gel.
6. Armazenamento e Entrega : O mRNA de eGFP purificado geralmente é armazenado a baixas temperaturas para manter a estabilidade. Para uso experimental, o mRNA pode ser entregue nas células usando vários métodos, incluindo eletroporação, lipofeção ou vetores virais, dependendo da aplicação específica e do tipo de célula alvo.
7. Expressão e Verificação : Assim que entra na célula, o mRNA de eGFP é traduzido em proteína fluorescente verde melhorada, que pode ser visualizada usando microscopia de fluorescência. Isso permite a verificação do sucesso na produção, entrega e expressão do mRNA.

Em resumo, a produção do mRNA de eGFP envolve clonar o gene, otimizá-lo para expressão, preparar um modelo de transcrição in vitro, realizar a reação de transcrição, purificar o mRNA resultante e, finalmente, entregá-lo nas células para expressão e verificação.

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