Técnicas de montagem inovadoras para síntese genética em larga escala

A tecnologia de montagem para sintetizar grandes fragmentos de DNA do zero é a pedra angular da síntese genética, abrangendo métodos como BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, montagem Gibson, CPEC e Overlap PCR. Devido às limitações da tecnologia atual na síntese precisa de DNA do comprimento do gene em uma única etapa, é necessário combinar técnicas de montagem in vitro e in vivo para montar fragmentos de oligonucleotídeos sintetizados em segmentos em longos fragmentos de DNA.

Técnicas de montagem in vitro

Eles são classificados em vários métodos com base no tamanho do fragmento e nas características da sequência, com um requisito comum para o uso de enzimas de ferramentas. A PCR de sobreposição, com base no método da DNA polimerase, é simples e rápida em operação. Os métodos BioBrick e BglBrick, que dependem de isosquizômeros, permitem a montagem padronizada, embora o método BioBrick seja inadequado para proteínas de fusão. O método de clonagem Golden Gate, com base em enzimas de restrição do tipo IIS, permite a ligação eficiente e contínua de vários fragmentos. O método de montagem Gibson, que utiliza uma combinação de várias enzimas de ferramentas, permite a ligação contínua com tamanhos de fragmentos que atingem várias centenas de kb. O design padronizado de componentes de DNA aumenta a taxa de utilização de fragmentos existentes.

Técnicas de montagem in vivo

Apesar in vitro fragmentos montados podem atingir várias centenas de kb de tamanho, o rendimento é frequentemente insuficiente, necessitando de amplificação usando organismos como Escherichia coli. Na montagem de fragmentos que excedem 20 kb, sistemas recombinantes dentro de organismos são frequentemente empregados, incluindo Bacillus subtilis, levedura e bactérias projetadas. A levedura, como um hospedeiro comumente usado, tem sido reconhecida por sua eficiente capacidade de recombinação homóloga por muitos anos. Ela pode ser usada para montar cromossomos artificiais de até várias megabases (Mb) de comprimento. Além disso, Saccharomyces cerevisiae exibe uma tolerância extraordinária para o comprimento do cromossomo, fornecendo uma base teórica para utilizar a levedura para construir cromossomos ultralongos em organismos superiores.

Aplicações

A Yaohai Bio-Pharma emprega principalmente dois métodos de montagem para síntese de genes: montagem de ligase e montagem de DNA polimerase. O método de montagem de ligase conecta fragmentos de oligonucleotídeos 5'-fosforilados sobrepostos e hibridizados em DNA fita dupla usando DNA ligase. O método de montagem de polimerase utiliza DNA polimerase para estender os fragmentos de oligonucleotídeos sobrepostos por meio de hibridização, obtendo uma mistura de diferentes comprimentos e, finalmente, amplificando os fragmentos completos montados com sucesso usando primers. A Yaohai pode ajudar os clientes a satisfazer requisitos específicos na síntese de genes.

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