Técnicas de Montagem Inovadoras para Síntese de Genes em Grande Escala

A tecnologia de montagem para sintetizar fragmentos grandes de DNA do zero é a pedra angular da síntese de genes, abrangendo métodos como BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, montagem Gibson, CPEC e Overlap PCR. Devido às limitações da tecnologia atual em sintetizar com precisão DNA de comprimento gênico em um único passo, é necessário combinar técnicas de montagem in vitro e in vivo para montar fragmentos de oligonucleotídeos sintetizados em segmentos em fragmentos longos de DNA.

Técnicas de montagem in vitro

Eles são classificados em vários métodos com base no tamanho do fragmento e nas características da sequência, com um requisito comum de uso de enzimas ferramenta. A PCR de sobreposição, baseada no método de DNA polimerase, é simples e rápida na operação. Os métodos BioBrick e BglBrick, que dependem de isoschizômeros, permitem montagem padronizada, embora o método BioBrick não seja adequado para proteínas de fusão. O método de clonagem Golden Gate, baseado em enzimas de restrição tipo IIS, permite a ligação eficiente e sem costura de múltiplos fragmentos. O método de montagem Gibson, que utiliza uma combinação de várias enzimas ferramenta, permite a ligação sem costura com tamanhos de fragmento alcançando várias centenas de kb. O design padronizado dos componentes de DNA aumenta a taxa de utilização dos fragmentos existentes.

Técnicas de montagem in vivo

Embora in vitro os fragmentos montados podem atingir vários centenas de kb de tamanho, mas o rendimento é frequentemente insuficiente, exigindo amplificação usando organismos como Escherichia coli. Na montagem de fragmentos excedendo 20 kb, sistemas recombinantes dentro de organismos são frequentemente empregados, incluindo Bacillus subtilis, levedura e bactérias modificadas. A levedura, como hospedeiro comumente utilizado, é reconhecida por sua capacidade eficiente de recombinação homóloga há muitos anos. Ela pode ser usada para montar cromossomos artificiais com até vários megabases (Mb) de comprimento. Além disso, Saccharomyces cerevisiae demonstra uma tolerância extraordinária ao comprimento do cromossomo, fornecendo uma base teórica para utilizar a levedura na construção de cromossomos ultra-longos em organismos superiores.

Aplicações

A Yaohai Bio-Pharma utiliza principalmente dois métodos de montagem para síntese de genes: montagem por ligase e montagem por DNA polimerase. O método de montagem por ligase conecta fragmentos oligonucleotídicos 5'-fosforilados que se sobrepõem e hibridizam em DNA de duas fitas usando DNA ligase. O método de montagem por polimerase utiliza DNA polimerase para estender os fragmentos oligonucleotídicos sobrepostos através da hibridização, obtendo uma mistura de diferentes comprimentos, e amplificando por fim os fragmentos de comprimento total montados com sucesso utilizando primers. A Yaohai pode ajudar os clientes a satisfazer requisitos específicos na síntese de genes.

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