Oppdagelsen av hemmelene bak høykvalitets plasmidekstraksjon

Ekstraksjon av plasmider er avgjørende for forskere. Som gener vektorer er plasmider vesentlige i vaccinforskning og geneterapi, hvor kvalitet teller. Nøkkelkvalitetsfaktorer inkluderer superlåst andel og endotoksininnhold. Reguleringer varierer: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, med <5% lineær/åpen-sirkulær DNA. Kunder foretrekker ofte ≥95% superlåst. Endotoksinnivåer er: forskning (>50 EU/µg), transfeksjon (<50 EU/µg), og endotoksinfri (<0.1 EU/µg).

Superlåst Plasmid-DNA

Plasmider fra Escherichia coli omfatter superlåst (SC), åpen-sirkulær (OC) og lineær (L) DNA. En høy SC-andel øker transfeksjons-effektiviteten og uttrykk. For eksempel er transfeksjonen av en 85.45% SC-plasmid 2.5 ganger høyere, og HGF-uttrykket av en 93.28% SC-plasmid 1.8 ganger høyere, som bekrefter SC-DNAs overlegenheter.

Åpen-sirkulær DNA: Når én av de to strekene i dobbeltstrengs DNA brytes, blir superløppede strukturen løsere og danner en åpen-sirkulær plasmid med større volum som migrerer langsomst under elektroforese og plasseres øverst.

Linjær DNA: Når begge strekene i plasmid-DNA brytes, danner det seg en linjær struktur med relativt mindre volum som migrerer raskere enn åpen-sirkulær DNA, men tregere enn superløppede DNA, og er plassert på andre plass.

Superløppede DNA: De to helisene fletter seg sammen og vriker seg til en superløppede struktur basert på DNA-helisen. Den har det minste volumet og migrerer raskest under elektroforese, og er plassert nederst.

Kvantitativ analyse av superløppede andel

Laboratorier bruker agarosegel-elektroforese (AGE) og Gel-Pro Analyzer for å vurdere andelen av superløppede DNA via elektroforesebilder. Et bilde viser 97,539% SC-DNA, mens et annet viser 63,833% SC-DNA og 36,167% OC-DNA (linjært DNA ikke synlig).

Hemmeligheten bak endotoksin i plasmider

Endotoksin er en komponent i den ytre laget av celleveggen til Gram-negativ bakterier, som frigis etter bakteriell død eller lysering, og inneholder giftig lipopolysaccharid A. Under plasmiduttrekk går endotoksin inn i lysesløsningen, hvilket påvirker transfeksjons-effektiviteten og utløser ikke-spesifikke immunresponser, noe som kan føre til falske positive resultater i eksperimentene.

Kvantitativ og kvalitativ analyse av endotoksin

Limulus amebocyt lysat (LAL)-testen oppdager endotoksin gjennom agglutinasjon med 2-keto-3-deoksyoktonsyrlige (KDO) i lipopolysaccharidet (LPS). Denne testen er kvalitativ og semi-kvantitativ, og indikerer tilstedeværelse av endotoksin ved klumpforming eller fargeendring når blandet med prøver.

Yaohai Bio-Pharma tilbyr endotoksinfrie supercoil-plasmider. Utsubkontrakt til Yaohai forsterker transfeksjons- og ekspresjons-effektiviteten. Leverte plasmider har ≥95% SC-proportjon (gj.snitt 85%±10%) og endotoksnivåer ≤0.1, ≤0.01, eller ≤0.005 EU/μg.

Vi søker også aktivt globale partnere, både institusjonelle og enkeltpersoner. Vi tilbyr den mest konkurransedyktige kompensasjonen i bransjen. Hvis du har noen spørsmål, ikke nøl med å kontakte oss: [email protected]