IVT mRNA-forberedelse

In vitro transkripsjon (IVT) er den foretrukne metoden for å forberede mRNA, og kan produsere mikrogram til milligram mRNA på laboratorisk nivå. For forskningsformål har kjemikalietleverandører utviklet fleksible IVT-reaksjonssystemer som er egnet for mRNA av moderat lengde (1000-4000 nukleotider).

I denne artikkelen skal vi summer opp in vitro transkripsjon (IVT) av mRNA, inkludert det konvensjonelle IVT-reaksjonssystemet som brukes på laboratorisk nivå og det IVT-reaksjonssystemet som er egnet for ultra-lange mRNA (>9000 nukleotider).

Setninger gjør det mulig å kapre co-transkripsjonelt med CleanCap AG og redusere immunogenitet med m1ψ. DNase I fjerner resterende DNA. Lav utbytte kan skyldes dårlig blanding, oksidasjon av kjemikalieer eller problemer med DNA-mal, noe som kan løses ved sentrifugering, friske kjemikalieer, kontroller og justering av malmengde/reaksjonstid.

Yaohai Bio-Pharma tilbyr ulike forhåndsproduserte IVT RNA-produkter (væske/frosne pulver) og LNP-ferdigprodukter, som kodder for proteiner som f.eks. fluoreserende proteiner (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinasjon Cre og antigen OVA, for å oppfylle ulike eksperimentelle eller prosjektbehov.

IVT-system for ultra-lange mRNA

Konvensjonell IVT kan ikke fungere for overordentlig lange mRNA (>9000 nt). En dyb forståelse og rasjonell justering av IVT-komponentene er nødvendig.

DNA-mal: Lineariserte plasmider eller PCR-produkter med tilsvarende promotorsekvenser, løst i RNase-fri H2O. En DNA-malkonsentrasjon høyere enn 40 nM anbefales for optimale IVT-betingelser.

DTT: Vedlikeholder enzymaktivitet under transkripsjon. Frisk DTT bør legges til reaksjonsbufferet for optimal enzymaktivitet.

RNase-hemmingsmidler: Hemmer RNase-aktivitet og vedlikeholder mRNA-stabilitet.

T7 RNA-polymerase: Katalyserer DNA-transkription til RNA, svarende til promotorsekvensen. Aktiviteten av T7 RNA-polymerasen påvirkes av pH og magnesiumioner.

Magnesiumioner (Mg2+): Et kofaktor for RNA-polymerasen. For lavt konvensjon reduserer transkripsjons-effektiviteten, mens for høye konvensjoner fører til RNA-degradering. Frie [Mg2+] bør justeres basert på nukleotidkonvensjon. Hver nukleotid binder en [Mg2+], så [Mg2+] konvensjonen bør overstige den totale nukleotidkonvensjonen.

Nukleosidtrifosfat (NTP): Som substrater er NTP'ene de grunnleggende byggesteinene i RNA. NTP-konvensjoner over 7 mM har en positiv effekt på mRNA-produksjonen.

Spermidin: Stabiliserer DNA-enzyme-komplekser og stimulerer transkripsjonsreaksjoner; imidlertid har for høye konvensjoner inhiberende effekter. Den anbefalte spermidinkonvensjonen ligger mellom 1 og 3 mM.

Inorganisk Pirofosfatase (PPase): Legges til i IVT-reaksjonene for å forhindre opphopning av anorganiske pyrofosfatjonner (PPi), unngår deres chelering med Mg2+ og sikrer tilstrekkelig fri Mg2+.

Med bruk av pionerende teknologi og erfaring fra IVT mRNA, tilbyr Yaohai Bio-Pharma en fullført IVT RNA-tjeneste, som omfatter sekvensdesign, IVT RNA-forberedelse (med m1ψ-modifikasjoner), RNA-syklisering, rensetning, frysedrying, LNP-kapsling og kvalitetstesting.

Vi søker også aktivt globale partnere, både institusjonelle og enkeltpersoner. Vi tilbyr den mest konkurransedyktige kompensasjonen i bransjen. Hvis du har noen spørsmål, ikke nøl med å kontakte oss: [email protected]