IVT mRNA-forberedelse

In vitro-transkripsjon (IVT) er den foretrukne metoden for fremstilling av mRNA, i stand til å gi mikrogram til milligram mRNA i laboratorieskala. For forskningsformål har reagensleverandører utviklet allsidige IVT-reaksjonssystemer egnet for mRNA av moderat lengde (1000-4000 nukleotider).

I denne artikkelen vil vi oppsummere in vitro-transkripsjon (IVT) av mRNA, inkludert det konvensjonelle IVT-reaksjonssystemet brukt i laboratorieskala og IVT-reaksjonssystemet egnet for ultralang mRNA (>9000 nukleotider).

Sett muliggjør co-transkripsjonell kapping med CleanCap AG og reduserer immunogenisitet med m1ψ. DNase I fjerner gjenværende DNA. Lavt utbytte kan skyldes dårlig blanding, reagensoksidasjon eller DNA-malproblemer, som kan reduseres ved sentrifugering, ferske reagenser, kontroller og justering av malmengde/reaksjonstid.

Yaohai Bio-Pharma tilbyr forskjellige prefabrikkerte IVT RNA-produkter (flytende/frysetørket pulver) og LNP-ferdige produkter, som koder for proteiner som fluorescerende proteiner (eGFP, mCHERRY), luciferase, rekombinase Cre og antigen OVA, for å møte forskjellige eksperimentelle eller prosjekter behov.

IVT-system for ultralangt mRNA

Konvensjonell IVT fungerer kanskje ikke for for langt mRNA (>9000 nt). En dyp forståelse og rasjonell justering av IVT-komponenter er nødvendig.

DNA-mal: Lineariserte plasmider eller PCR-produkter med tilsvarende promotersekvenser, oppløst i RNase-fri H2O. En DNA-templatekonsentrasjon høyere enn 40 nM anbefales for optimale IVT-forhold.

DTT: Opprettholder enzymaktivitet under transkripsjon. Fersk DTT bør tilsettes reaksjonsbufferen for optimal enzymaktivitet.

RNase-hemmer: Hemmer RNase-aktivitet og opprettholder mRNA-stabilitet.

T7 RNA polymerase: Katalyserer DNA-transkripsjon til RNA, tilsvarende promotorsekvensen. Aktiviteten til T7 RNA-polymerase påvirkes av pH og magnesiumioner.

Magnesiumioner (Mg2+): En kofaktor for RNA-polymerase. For lave konsentrasjoner reduserer transkripsjonseffektiviteten, mens for høye konsentrasjoner fører til RNA-nedbrytning. Fri [Mg2+] bør justeres basert på nukleotidkonsentrasjon. Hvert nukleotid chelaterer en [Mg2+], så [Mg2+]-konsentrasjonen bør overstige den totale nukleotidkonsentrasjonen.

Nukleosidtrifosfater (NTP): Som underlag er NTP-er de grunnleggende enhetene til RNA. NTP-konsentrasjoner over 7 mM har en positiv innvirkning på mRNA-produksjonen.

Spermidin: Stabiliserer DNA-enzymkomplekser og stimulerer transkripsjonsreaksjoner; for høye konsentrasjoner har imidlertid hemmende effekter. Den anbefalte spermidinkonsentrasjonen er mellom 1 og 3 mM.

Uorganisk pyrofosfatase (PPase): Lagt til IVT-reaksjoner for å forhindre akkumulering av uorganiske pyrofosfationer (PPi), unngå chelering med Mg2+ og sikre tilstrekkelig fritt Mg2+.

Ved å utnytte banebrytende teknologi og IVT mRNA-erfaring, tilbyr Yaohai Bio-Pharma en one-stop IVT RNA-tjeneste, som omfatter sekvensdesign, IVT RNA-prep (med m1ψ-mods), RNA-cyklisering, rensing, frysetørking, LNP-innkapsling og kvalitetstesting.

Vi søker også aktivt etter institusjonelle eller individuelle globale partnere. Vi tilbyr den mest konkurransedyktige kompensasjonen i bransjen. Hvis du har spørsmål, kan du gjerne kontakte oss: [email protected]