Utnytte kraften i Fed-batch-fermenteringsstrategi

Pichia pastoris er mye brukt i produksjonen av ulike heterologe proteiner. High-Cell-Density Fermentation (HCDF)-teknologien, implementert gjennom Fed-Batch-mating, har oppnådd storskala produksjon av biofarmasøytiske midler og industrielle enzymer. I nøyaktig kontrollerte medier kan bruken av HCDF-teknologi oppnå høyytelse, høyaktivitet og kostnadseffektive rekombinante proteiner.

Nyere forskning indikerer at det gjennom HCDF-strategier arbeides for å øke produksjonen og aktiviteten av heterologe proteiner i Pichia pastoris. HCDF-teknologi muliggjør uanstrengt oppnåelse av celleklynger på høyt nivå i definerte medier, og muliggjør dermed anskaffelse av rikelig med rekombinante proteiner med økt aktivitet og reduserte kostnader gjennom HCDF. Imidlertid er det fortsatt en utfordring å velge riktig HCDF-strategi for å optimere uttrykket på høyt nivå av spesifikke proteiner i Pichia pastoris.

Fermentering med høy celletetthet (HCDF)

Pichia pastoris utmerker seg i heterolog proteinproduksjon, foretrukket for HCDF i automatiserte bioreaktorer. HCDF har 3 stadier: glyserolbatch, fôring og metanolinduksjon. Yaohai Bio-Pharma har over et tiår med erfaring innen mikrobiell gjæring og har tjent over 400 prosjekter. Selskapet besitter omfattende kompetanse og velutviklet teknologi, som gjør det mulig å bruke ulike HCDF-strategier for å effektivisere proteinproduksjonen.

Metanol fungerer både som en induser av AOX1 og en karbonkilde, men konsentrasjonen må kontrolleres for å forhindre toksisitet. Evaluering av ulike metanolfôringsstrategier er avgjørende for å optimalisere veksten av Pichia pastoris og proteinuttrykk

Metanolinduksjonsstrategi

I fed-batch HCDF metanolinduksjonsstrategien omfatter statsbaserte induksjonsstrategier et sett med kontrollmetodikker som regulerer tilleggstilsetning av metanol gjennom online/offline eller forover/revers kontroll. Blant de statistiske induksjonsstrategiene inkluderer de viktigste μ-stat, oppløst oksygen (DO)-stat, metanol-stat og biomasse-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat-strategi holder biomassen jevn ved å kontrollere μ, hjelpe reproduserbarheten og studere μs effekt på proteinuttrykk. Imidlertid mangler den direkte metanol- og DO-kontroll, og risikerer akkumulering og ROS-generering.

1.2 DO-stat

DO-stat-strategien regulerer indirekte metanolfôret ved å kontrollere det oppløste oksygenet for å opprettholde oksygenering, men den fikserer ikke metanolkonsentrasjonen og veksthastigheten, noe som kan påvirke studiet av proteinuttrykk. Oksygenering utgjør en utfordring i aerob gjæring, og mens tilskudd av rent oksygen kan være kostbart og giftig, er trykkøkning en mer økonomisk tilnærming som også kan øke proteinaktiviteten.

1.3 Metanol-stat

Utilstrekkelig kontroll av metanolkonsentrasjonen utgjør begrensninger for både μ-stat og DO-stat strategier. Metanol statistiske strategier, som opererer i en på/av-modus, er utsatt for svingninger og mangler presisjon. I motsetning til dette tilbyr PID-kontrollere en mer presis regulering av metanolkonsentrasjonen, noe som forbedrer den generelle gjæringseffektiviteten.

1.4 Biomasse-stat

Biomasse-statstrategien definerer forholdet mellom biomasse og metanolfôring, og optimaliserer metanolfôringshastigheten for å øke proteinutbyttet. Online overvåking av biomasse er mer praktisk, med flowcytometri som den foretrukne metoden. I en 1000L-skala forbedrer optimering av metanoltilførselshastigheten enzymaktiviteten, utbyttet og produktiviteten betydelig, og overgår flaskegjæringen.

Samfôringsstrategi

Glyserol, som en AOX1-promoterhemmer, må konsumeres fullstendig før metanolinduksjon for å unngå å undertrykke proteinproduksjonen. Kosubstrater kan øke enzymaktiviteten, men overflødig glyserol kan skade vekst og ekspresjon. Sorbitol, askorbinsyre, mannitol og andre kan erstatte glyserol, redusere proteolyse og dyrkingstid, og forbedre proteinuttrykk.

Stammebanken nødvendiggjør å ta i bruk passende konserveringsmetoder og plassering i et passende miljø for å opprettholde stabiliteten til tøyningsegenskapene. Yaohai Bio-Pharma kan oppfylle kravene til konservering av glyserollager (via frysere med ultralav temperatur eller flytende nitrogen) og frysetørkende konservering av gjær og E. coli.

Restriksjon-indusert strategi

I Pichia pastoris øker restriktive forhold som lav DO, metanolkonsentrasjon og oksygen ekspresjon av rekombinant protein. Oksygenbegrensede forhold aktiverer AOX1-promoter via metanolakkumulering, og øker proteinproduksjonen samtidig som den reduserer varmen. Lav-temp induksjon øker utbytte, aktivitet, stabilitet og cellelevedyktighet, men legger til kjølekostnader. pH- og nitrogenbegrensning hjelper også til å uttrykke seg, noe som krever forsiktighet for å unngå driftsproblemer. Nitrogenbegrensning øker spesielt spesifikk proteinproduktivitet.

Yaohai Bio-Pharma søker også aktivt etter institusjonelle eller individuelle globale partnere og tilbyr den mest konkurransedyktige kompensasjonen i bransjen. Hvis du har spørsmål, kan du gjerne kontakte oss: [email protected]