Å utnytte kraften i Fed-batch Fermentasjonstrategi

Pichia pastoris brukes mye i produksjonen av ulike heterologe proteiner. High-Cell-Density Fermentation (HCDF)-teknologien, implementert gjennom Fed-Batch-fôring, har med sucess oppnådd storstilt produksjon av biomedisiner og industrielle enzymer. I nøyaktig kontrollerte medier kan bruk av HCDF-teknologien føre til høyavkastning, høy aktivitet og kostnadseffektive rekombinante proteiner.

Nylig forskning viser at gjennom HCDF-strategier gjøres innsats for å øke produksjonen og aktiviteten av heterologe proteiner i Pichia pastoris. HCDF-teknologien tillater enkelt å oppnå høy nivå av cellekluster i definerte medier, noe som gjør det mulig å få store mengder rekombinante proteiner med forbedret aktivitet og reduserte kostnader gjennom HCDF. Likevel er valg av den riktige HCDF-strategien for å optimere høygradsuttrykket av spesifikke proteiner i Pichia pastoris fortsatt en utfordring.

High-Cell-Density Fermentation (HCDF)

Pichia pastoris presterer utmerket i fremmed proteinfremstilling, foretrukket for HCDF i automatiserte bioreaktorer. HCDF har 3 faser: glyserolbatch, føding og metanolinduksjon. Yaohai Bio-Pharma har over ett tiår med erfaring innen mikrobiell ferming og har tjenestegjort over 400 prosjekter. Selskapet eier omfattende kunnskap og godt utviklet teknologi, noe som gjør det mulig å bruke ulike HCDF-strategier for å forbedre effektiviteten av proteinfremstilling.

Metanol fungerer både som inducer av AOX1 og som karbonkilde, men dens konsentrasjon må kontrolleres for å unngå toksisitet. Å vurdere ulike metanolfødningsstrategier er avgjørende for å optimalisere veksten til Pichia pastoris og proteinekspresjon.

Metanolinduksjonsstrategi

I den fed-batch HCDF-metanolinduksjonsstrategien omfatter tilstandsbaserte induksjonsstrategier en mengde kontrollmetodologier som regulerer den supplementære tilsetningen av metanol gjennom online/offline eller fremover/bakover kontroll. Blant de statistiske induksjonsstrategiene er de hovedsaklige μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, metanol-stat og biomass-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat-strategien holder biomassen stabil ved å kontrollere μ, noe som bidrar til gjentakelighet og studier av μ's påvirkning på proteinettrykk. Likevel mangler den direkte kontroll av metanol og DO, hvilket kan føre til akkumulering og ROS-generering.

1.2 DO-stat

DO-stat-strategien regulerer indirekte metanolføringen ved å kontrollere den dissolverte oksygen for å opprettholde oksygenasjon, men den fastsetter ikke metanol-konsentrasjonen og vekstfarten, noe som kan påvirke studiet av proteinet uttrykk. Oksygenasjon stiller en utfordring i aerob fermentasjon, og selv om tilskudd av ren oksygen kan være kostbar og toksisk, er trykkforsterkning en mer økonomisk tilnærming som også kan forbedre proteinkvaliteten.

1.3 Methanol-stat

Utilstrekkelig kontroll av metanol-konsentrasjon setter grenser for både μ-stat- og DO-stat-strategiene. Metanol-statistiske strategier, som opererer i et på/av-läge, er utsatt for svingninger og mangel på nøyaktighet. I motsetning til dette tilbyr PID-kontroller en mer nøyaktig regulering av metanol-konsentrasjonen, noe som forsterker den generelle effektiviteten i fermentasjonen.

1.4 Biomass-stat

Biomass-stat-strategien definerer forholdet mellom biomasse og metanolføding, med optimalisering av metanolfødringshastigheten for å øke proteinyield. Oppfrisket overvåking av biomassen er mer praktisk, med flow cytometry som den foretrukne metoden. På en 1000L-skala forbedrer optimaliseringen av metanolfødringshastigheten betydelig enzymaktivitet, yield og produktivitet, og overgår flaskehfermentasjon.

Ko-fødingstrategi

Glyceroll, som en AOX1 promotorhemmer, må være fullstendig forbrukt før metanolindusjon for å unngå å hemme proteinfremstilling. Ko-substrater kan forbedre enzymaktiviteten, men for mye glyceroll kan skade vekst og uttrykk. Sorbitoll, askorbinsyrl, mannitol og andre kan erstatte glycerollen, redusere proteolyse og oppdrettstid, og forbedre proteinuxtrykk.

Strainbanken krever at man bruker hensiktsmessige bevaringsmetoder og plassering i et passende miljø for å opprettholde stabilheten til stregetegenskapene. Yaohai Bio-Pharma kan dekke kravene for bevaring av glyserollager (via ultralave temperaturkjøler eller væskekvilestykken) og frysedrying-bevaring av gjer og E. coli.

Restriksjon-indusert strategi

I Pichia pastoris øker restriktive vilkår som lav DO, metanol-konsentrasjon, og oksygenbegrensning uttrykket av rekombinante proteiner. Oksygen-begrensete vilkår aktiverer AOX1-promotoren gjennom akkumulering av metanol, hvilket øker proteinkvantum mens varmen reduseres. Lavtemperaturindukasjon forbedrer utbytte, aktivitet, stabilitet og celleoverlevelse, men legger til kjølomkostninger. pH og nitrogenbegrensning støtter også uttrykket, med nødvendighet for forsiktighet for å unngå driftsmessige problemer. Nitrogenbegrensning forsterker spesielt proteinkvaliteten betydelig.

Yaohai Bio-Pharma søker også aktivt globale partnere, både institusjonelle og enkeltpersoner, og tilbyr den mest konkurransedyktige kompensasjonen i bransjen. Hvis du har noen spørsmål, hesitate ikke å kontakte oss: [email protected]