mRNR 3' poli(A) apibūdinimas
mRNR 3' poli(A) apibūdinimas
3' poli(A) mRNR uodega (poliadenozinai) yra neatskiriama potranskripcijos reguliavimo dalis, daranti įtaką mRNR eksportui, stabilumui ir transliacijai. In vitro transkribuotų (IVT) mRNR atveju poli (A) uodega įvedama arba per transkripciją pagal šabloną, arba per fermentinį uodegos procesą ne šabloniniu būdu. Šis 3′ poli(A) tarnauja kaip kritinis IVT RNR kokybės požymis (CQA), todėl būtina nuodugniai apibūdinti tiek proceso kūrimo, tiek partijos išleidimo metu.
„Yaohai Bio-Pharma“ teikia specializuotas 3' poli(A) charakteristikų nustatymo paslaugas, taikydama tokius metodus kaip ribonukleazės T1 (RNazės T1) skilimas, jonų poros atvirkštinės fazės didelio efektyvumo skysčių chromatografija (IP-RP-HPLC) / skysčių chromatografija-masių spektrometrija. (LC-MS) ir išsamią duomenų analizę.
Reguliavimo reikalavimai mRNR 3' poli(A) apibūdinimui
Remiantis PSO reguliavimo svarstymais, „mRNR struktūros vientisumas laikomas kritiniu kokybės požymiu mRNR išsiskyrimui. Taigi reikia kontroliuoti mRNR vientisumą, 5 ′ uždengimo efektyvumą, 3′ poli(A) uodegos buvimą ar ilgį ir pan.
Analitinis metodas
Analizė |
Metodai |
mRNR 3' poli(A) apibūdinimas |
LC-MS po virškinimo |
Procedūra
1 veiksmas. RNazės T1 skilimas
Tiesioginė viso ilgio nepažeistos mRNR analizė LC-MS yra nepraktiška dėl jos dydžio ir nevienalytiškumo. Norint ištirti poli(A) uodegą, ji turi būti atskirta nuo viso ilgio mRNR. Paplitęs metodas apima fermentinį virškinimą su RNaze T1, selektyviai suskaidant rG 3' galą, išsaugant poli (A) seką. MRNR mėginys virškinamas su RNaze T1, o skilimo fragmentai, turintys poli(A) ruožų, išskiriami naudojant oligo dT dengtas magnetines granules.
2 veiksmas. IP-RP-HPLC/LC-MS
Išskirtos uodegos buvo analizuojamos naudojant LC-MS, pateikiant tikslią uodegos ilgio informaciją vieno nukleotido skiriamąja geba. Atliekant oligonukleotidų LC-MS analizę, jonų poravimo atvirkštinės fazės (IP-RP) atskyrimas su amino judriosios fazės priedais yra tinkamiausias chromatografinis režimas dėl jų tvirtos skiriamosios gebos ir suderinamumo su masių spektrometrija (MS).
3 žingsnis. Duomenų analizė
Poli(A) uodegos ilgis ir jo santykinis gausumas priklauso nuo smailių skaičiaus ir intensyvumo, padalytų iš adenozino masės. Apdorojant arba išskaidžius masių spektrą, nustatoma numatoma 100-merų poli(A) uodegos masė (33,163 329 Da langelyje) kartu su masių serija, išdėstyta XNUMX amu atstumu, atitinkančia adenozino (A) masę. .
3' poli(A) apibūdinimas naudojant LC-MS
Yaohai-BioPharma sukūrė patikimą mRNR 3' poli(A) apibūdinimo metodą, įskaitant RNazės T1 skilimą ir IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma sukūrė patikimą mRNR 3' poli(A) apibūdinimo metodą, įskaitant RNazės T1 skilimą ir IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
