mRNR 5' uždengimo efektyvumas
mRNR 5' ribos efektyvumo analizės reikšmė
Dangtelio struktūra, esanti 5′ mRNR gale, atlieka pagrindinį vaidmenį efektyviam mRNR vertimui, stabilizavimui ir transportavimui eukariotuose. In vitro transkribuotos (IVT) mRNR kontekste 5' dangtelis įvedamas per bendro transkripcijos ribojimo arba fermentinio dangtelio procesus. Kaip nepakeičiama IVT RNR sudedamoji dalis, 5′ dangtelis yra esminis kokybės požymis (CQA), kurį reikia išsamiai apibūdinti proceso kūrimo ir partijos išleidimo metu.
Yaohai-Bio Pharma teikia išsamius 5' dangtelio efektyvumo analizės sprendimus, apimančius oligonukleotidų įtvarų (zondo) dizainą, RNazės H skilimą, IP-RP- jonų poros atvirkštinės fazės aukštos kokybės skysčių chromatografiją (IP-RP-HPLC) / skysčių chromatografiją. -masių spektrometrija (LC-MS), duomenų analizė.
Reguliavimo reikalavimai mRNR vientisumui
Remiantis PSO reguliavimo svarstymais, „mRNR struktūros vientisumas laikomas kritiniu kokybės požymiu mRNR išsiskyrimui. Taigi reikia kontroliuoti mRNR vientisumą, 5 ′ uždengimo efektyvumą, 3′ poli(A) uodegos buvimą ar ilgį ir pan.
Analitinis metodas
Analizė |
Metodai |
mRNR 5' uždengimo efektyvumas |
LC-MS po virškinimo |
Procedūra
1 žingsnis. Oligonukleotidų įtvarų (zondo) projektavimas
Skaldymo zondas, apimantis 2'-O-metilnukleotidus ir tetradeoksiribonukleotidus, padeda atskirti komplementarią RNR grandinę tam tikrose vietose, kai yra RNazės H. Šis metodas yra labai vertingas tikslinei didesnių RNR fragmentų generacijai.
2 žingsnis. RNazės H skilimas
Biotinilintas zondas, strategiškai suprojektuotas taip, kad papildytų mRNR 5' galą, naudojamas kartu su RNaze H, siekiant katalizuoti tikslinį 5' galo oligonukleotido, turinčio dangtelio struktūrą, skilimą.
3 veiksmas. IP-RP-HPLC/LC-MS
Atliekant oligonukleotidų LC-MS analizę, tinkamiausias chromatografinis režimas yra jonų poravimo atvirkštinės fazės (IP-RP) atskyrimas naudojant mobiliosios fazės priedus. Taip yra dėl jų puikios skiriamosios gebos ir suderinamumo su masės spektrometrija (MS).
4 veiksmas. Duomenų analizė
Skirtingos masės, pastebėtos skilimo fragmentuose su m7GpppG dangteliu, priešingai nei su difosfatu, trifosfatu arba nemetilintu G dangteliu (GpppG), palengvina jų identifikavimą ir leidžia įvertinti dangtelio efektyvumą.
Apribojimų efektyvumo analizė su LC-MS atvejis
Yaohai-Bio Pharma sukūrė patikimus mRNR ribojimo efektyvumo analizės metodus, nuo oligonukleotidų įtvarų (zondo) projektavimo, RNazės H skilimo, IP-RP-HPLC/LC-MS iki duomenų analizės.
5' galo skilimo fragmentų suminės jonų chromatogramos (kairėje) ir elektropurškimo masės spektrai (dešinėje)
EN
